哺乳動物Cas9表達質粒載體

CRISPR/Cas9核酸酶表達載體是當前幾種(zhǒ開學ng)流行的基因編輯工具之一，可以快速有效地在基因組靶序刀路列上創造突變（其它兩(liǎng)種錢樹(zhǒng)常見的工具是ZFN和TALEN）。

Cas9是RNA引導DNA核酸酶，是天然原核免疫系統訊玩的一部分，賦予細菌産生對(duì)質粒和噬菌體等南作外源遺傳物質的抵抗能(néng)力。在細化錢胞内，Cas9核酸酶與引導RNA（gRNA靜讀）形成(chéng)複合物，該複合物通過(guò)與基因組中的18-22 nt信影的同源靶序列直接相互作用，gRNA與靶位點他數通過(guò)互補配對(duì)使可兵Cas9定位到靶序列上，然後(子會hòu)切割基因組中的靶位點。

使用CRISPR打靶目的基因需要目标細藍多胞同時(shí)表達Cas9和特異gRNA。這(zhè)可以通鄉廠過(guò)在同一個載體上共表達Cas9和gRNA，也可以通過(guò文空)在兩(liǎng)個載體各上自表達校農Cas9和gRNA來實現。使用Cas9和gRNA兩(liǎng)個載體分開(開美kāi)表達的優勢在于可使用不同的gRNA與不同歌不的Cas9變體組合（如Cas9n，dCas9），從的靜而帶來更多變的實驗方案。

我們的常規Cas9表達質粒載體可以直接轉染哺乳動物細胞，方法如同大多數實驗室的去就傳統轉染方法一樣(yàng)，操作上非常簡分樹便。質粒轉染要注意的是，這(zhè)種(zhǒng)方法屬于瞬時(件錢shí)轉染，隻有極小一部分的細胞中裡議的質粒序列會(huì)穩定整合到細胞基因組中人商（整合幾率的典型值小于1%）。

我們提供多種(zhǒng)版本的來源于S鐵放treptococcus pyogenes的SpCas9。商資這(zhè)其中包括hCas9，人源化的野生型SpCas9，能(néng)風事有效地在靶序列制造DNA雙鏈斷裂（DSB）；hCas9-DA10亮習，核酸酶突變型的人源hCas9，隻對(章空duì)靶序列的DNA單鏈造成(chéng)切口；dCas9，包含D1空離0A和H840A突變，屬于無核酸酶活性的SpCas9；SpC熱坐as9-HF1，親和性強化的SpCas9；以及eSpCas9，特異性強化的Sp要南Cas9。dCas9融合轉錄激活結構域如dCas9/VP車湖64和dCas9/VPR，或者融得房合轉錄抑制結構域後(hòu)，如dCas9/K影做RAB，可分别應用于CRISPRa和CRISPRi系統。此外，我和銀們提供的來源于Staphyloc著物occus aureus的SaCas9，其序列要比SpCas9和來源于Acid拿兒aminococcus的AsCpf1更短（AsCpf1屬于新一代CRISP又購R基因編輯系統。AsCpf1造成(chéng)DSB時南時(shí)，兩(liǎng)條DNA鏈上的切口位置相互錯還門開(kāi)，形成(chéng)粘性末端）。

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關于該載體系統的更多信息，請參考以下文獻。

瞬時(shí)表達：轉染Cas9表達質粒載體可以在靶細胞中這得獲得高水平的Cas9蛋白表達瞬時(sh員看í)峰值。在無藥篩的情況下，基爸唱因編輯完成(chéng)後(hòu)Cas9質哥物粒載體會(huì)逐漸從細胞中丢失。

靈活性：Cas9表達質粒載體可與多種(zhǒn分讀g)不同的gRNA共轉染至細胞中以打靶多個位點。

技術簡單：常規轉染即可把質粒轉入細胞，相比起(qǐ)病毒載體需要進林兵(jìn)行病毒包裝，過(guò)程更簡單。玩很

高水平表達：常規質粒轉染細胞後(hòu)，可以産生非常高的拷國錢貝數（每個細胞多達幾千拷貝），使外源基因能(n拿議éng)高水平表達。

載體DNA非整合型：常規質粒在細胞裡(lǐ)主要以遊離DNA狀态存在，所以常規質粒轉染也稱爲瞬時(關算shí)轉染。然而，質粒DNA也可以以非常低的概率永久整合到宿主基因組中（有爸質粒轉染每10²~10⁶個細胞可能(néng)會(huì)有坐校一個細胞的基因組被(bèi)整合，下些整合效率取決于細胞類型）。如果將(jiāng)攜帶了藥物筆去抗性基因或者熒光标記基因的載體轉到細胞中，在經(jīng)過(guò)鄉公擴大和傳代培養後(hòu)，可以使用藥物篩選或細胞分選來獲得朋個穩定整合了該載體的細胞。

可轉染的細胞類型受限：不同類型細胞的質粒轉染效率差異很大。非分裂細胞比分裂細胞更看多難轉染，原代細胞比永生化細胞系更難轉染。一些重要的細胞類型更是但能難以轉染，如神經(jīng)元和胰島β細胞。另外，質粒轉染局限于體外細胞實驗，下志很少運用到活體實驗。

基因拷貝數在不同細胞中呈現差異性：盡管成(chéng)功的轉染可以在單個細胞裡(lǐ)産生非常高的拷貝數，但不輛國同細胞間卻有高度的差異性。在一些細胞中，質筆要粒拷貝數非常高，而在另外一些細胞卻是低拷貝甚至沒(méi)有她謝。而病毒轉導更傾向(xiàng)于相對(duì)均勻地把基因轉線一到細胞中。

PAM序列依賴: CRISPR/Cas9靶向(xiàng)特定位點時(shí)對拍窗(duì)gRNA識别序列3'端的PA厭電M序列有嚴格要求。不同類型的Cas電河9蛋白需要使用不同的PAM序列。

Promoter: The promoter that drives t下慢he expression of th店信e downstream Cas9 gene is place大知d here.

Kozak: Kozak consensus sequence. It is placed風你 in front of the start codon of the腦著 ORF of interest because it i視南s believed to facilitate translation拿吧 initiation in 站資eukaryotes.

ORF: The open reading frame of th著放e Cas9 nuclease variant chos要男en by the user.

SV40 late pA: Simian virus 40 late polyadenylati爸費on signal. It f呢照acilitates transc著山riptional termination of the upstream O商計RF.

Marker: A drug selection gene (such a訊得s neomycin resistance), a visu看草ally detectable gene秒音 (such as EGFP), or a dual-reporter鐵暗 gene (such as EGFP/Neo)暗制. This allows cells transduc費司ed with the vector to be selected 拍化and/or visualize光說d.

pUC ori: pUC origin of replicatio吃開n. Plasmids carry就相ing this origin exist in high 但舞copy numbers in E. coli.

Ampicillin: Ampicillin resistance 弟黑gene. It allows th文電e plasmid to be maintained by ampicilli喝腦n selection in E. coli.

我們的Cas9表達載體可使用用戶自定義的啓動子實現Cas9蛋白的高水平表達。笑河我們提供多種(zhǒng)類型的做訊Cas9蛋白以滿足不同的實驗需求。Cas9表達載體系統已經女商(jīng)過(guò)優化，其在大腸杆菌中具有高拷貝複制能(néng)力還森，且對(duì)細胞具有高效轉染率。根據用戶選擇的篩選她關标記基因，可對(duì)轉染了該載體的細胞進(jìn)行篩選或者可視長如化追蹤。

瞬時(shí)表達：轉染Cas9表達質粒載體可以在靶細胞中獲得高水平的Cas9蛋白表達瞬時(s民科hí)峰值。在無藥篩的情況下，基因編輯完成(chéng)後(hò鐘友u)Cas9質粒載體會(huì)逐漸從細胞中丢失。

靈活性：Cas9表達質粒載體可與多種(zhǒng)不同計腦的gRNA共轉染至細胞中以打靶村老多個位點。

技術簡單：常規轉染即可把質粒轉入細胞，相比起(qǐ)病毒載喝術體需要進(jìn)行病毒包裝，過(guò)程更簡單。離麗

高水平表達：常規質粒轉染細胞後(hòu)，可以産生非常高的拷貝數（每個細胞多達幾千明嗎拷貝），使外源基因能(néng)高水平表達農自。