哺乳動物基因Tet-On誘導表達載體

概述

Tet-On誘導型基因表達系統是控制哺乳動物細胞中從路目的基因定時(shí)表達的強大工具。Tet-O校刀n誘導型基因表達載體作用：當不存在四環素及其類似物（如d國路oxycycline）的情況下，目的基因幾乎或完全沉默；當往知村體系中添加四環素或其他類似物（如doxycycline）時(shí)，目的基因窗湖得到快速高水平表達。這(zhè)是通過(如藍guò)多組分系統實現的，即四環素不存在的情況下，tTS蛋白使得基因沉默；你司四環素存在的情況下，rtTA蛋白使得基因正常表達。

在生物醫學(xué)領域，利用化照常規轉染將(jiāng)質粒載體轉到哺乳動物細好唱胞中是使用最廣泛的方法。雖然近年來開(kāi)發(fā)了不少更爲先進(jìn黃為)的基因導入載體系統（如慢病毒載體、腺病毒載體、AAV載體和piggyBa計湖c等），但常規質粒基因表達載體仍被(bèi黑術)大多數實驗室使用，這(zhè)主要得校畫益于其在技術上的簡便性以及在各種(zhǒ亮近ng)類型細胞中的高效轉染率。常規質粒載體轉染的關鍵特點是短暫性，并且在宿河農主基因組中的整合效率非常低（通常小于1%）。

關于該載體系統的更多信息，請參如筆考以下文獻。

參考文獻	主題
Science 268:1766-1769 (1995)	Development of rtTA.
J Gene Med. 1:4-12 (1999)	Development of tTS.

亮點

我們的Tet-On誘導型基因表達載體旨在—當電厭缺乏四環素時(shí)，實現目的基因的幾乎或完全沉默；當往體服動系中添加四環素時(shí)，目的基因得到快速高水要務平表達。我們的載體系統已經(jīng)過(匠吧guò)優化，其在大腸杆菌中具有高拷貝複制能(néng)力，且對(duì)務森細胞具有高效轉染率。

優點

基因表達定時(shí)調控：隻依賴rtTA的Tet-on系也報統在沒(méi)有誘導劑的情況下，會(huì)有明顯的洩露表湖喝達。我們的Tet-On基因表達載體可嚴格調控基因的表達，爸說在沒(méi)有誘導劑的情況下可將(jiāng)背景洩露表達最小化，并保持該系子花統對(duì)四環素誘導的高靈敏度。

技術簡單：常規轉染即可把質粒轉入細胞，相比起(qǐ)病毒載體需要進(jìn)行病毒木都包裝，過(guò)程更簡單。

載體容量非常大：我們的載體總容量可達30 kb，其中質粒骨架和Tet-On元光高件隻占4.6 kb，有足夠大的容量可以放置客戶所感興趣了下的序列。

高水平表達：TRE啓動子可驅動目标基因在誘導狀态下高水平表達。長也另外，常規質粒轉染細胞後(hòu)，可以産生非常高的拷貝數（每個細胞多達會花幾千拷貝），使外源基因能(néng個好)高水平表達。

不足之處

載體DNA非整合型：常規質粒在細胞裡(lǐ)主要以遊離DNA狀态存在，照分所以常規質粒轉染也稱爲瞬時(shí)轉染。然而，質粒DN山醫A也可以以非常低的概率永久整合到宿主基因組中（質粒轉染如新每10²~10⁶個細胞可能(néng)會(huì)有一個細胞的基因組被(bè靜爸i)整合，整合效率取決于細胞類型）。如果開商將(jiāng)攜帶了藥物抗性基因或者熒光标記基什如因的載體轉到細胞中，在經(jīng)窗行過(guò)擴大和傳代培養後(hò說做u)，可以使用藥物篩選或細胞分選來獲得穩定整合了該載體的細胞。

可轉染的細胞類型受限：不同類型細胞的質粒轉染效率差異很大近議。非分裂細胞比分裂細胞更難轉染，原代細要綠胞比永生化細胞系更難轉染。一些重要的細胞類型更是難以轉染，如神經(jīng)為銀元和胰島β細胞。另外，質粒轉染局限于體外細胞實驗，很話車少運用到活體實驗。

基因拷貝數在不同細胞中呈現差異性：盡管成(chéng)功的轉染可以在單個細胞裡(lǐ)産生非常高還飛的拷貝數，但不同細胞間卻有高度的在用差異性。在一些細胞中，質粒拷貝數非常高，而在另外一些細胞卻銀你是低拷貝甚至沒(méi)有。而病毒轉導更傾向(購做xiàng)于相對(duì)均勻地把基因轉到細胞中。

載體關鍵元件

TRE: Tetracycline-responsiv費們e element promoter (2nd genera南紙tion). This element can be regula為的ted by a class of transcri員鐘ption factors (e.g. tTA, rtTA and tTS)木吃 whose activities are dependent錢我 on tetracycline or its analogs (e.g微去. doxycycline).

Kozak: Kozak consensus sequence. It is placed姐影 in front of the start codon of the ORF信高 of interest to facilitat要科e translation in刀房itiation in eukaryotes.

ORF: The open reading frame間習 of your gene of interest is placed h那城ere.

SV40 late pA: Simian virus 40 l劇科ate polyadenylation signal. 街術It facilitates transcriptional te章科rmination of the upstream ORF.

Promoter: 麗老The promoter chosen to drive expression師章 of the tTS/rtTA cassette.

tTS: Tetracycline-controlled tr睡呢anscriptional silencer. This protein b紙技inds to TRE promoter t那議o actively suppress gene tran舊市scription only in the absence of tetra術近cycline and its analogs (e.g. doxycycl理男ine).

T2A: Self-cleaving 2A p在商eptide from thosea asigna vi女草rus that allows multiple proteins 雜樂to be made from a poly她厭cistronic transcript co資能ntaining multiple ORF明音s separated by T2A. The cleav吃舞age occurs through 鄉新a putative “ribosomal ski為子pping” mechanism.

rtTA: Reverse tetracycline responsive去的 transcriptional activator M2 (2吃數nd generation). This pro船船tein binds to TRE promoter 遠地to activate gene tra大費nscription only in th南中e presence of tetracycline or its ana電生logs (e.g. doxycycline). 朋大It has higher sensitivity日北 to the inducing drug and lower leak線用y activity in the a城影bsence of the drug 吃刀compared to its predecess票商or.

BGH pA: Bovine growth hormone p離開olyadenylation. It facilita著資tes transcriptional t森答ermination of the tTS/rtTA cassette.

Ampicillin: Ampicillin resista費路nce gene. It allows 北北the plasmid to be main妹事tained by ampicillin selecti湖飛on in E. coli.

pUC ori: pUC origin of replication. Plasmid知筆s carrying this origin exist in high 都志copy numbers in E. coli.

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