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哺乳動物基因FLEX條件性表達腺病毒載體（Cre-On兵你）
概述
FLEX介導條件性表達腺病毒載體結合了載體家的高效的腺病毒載體系統水計和Cre響應的FLEX條件性基因表達載體，可以幫謝呢助您實現在多種(zhǒng)多樣(yàng)的哺乳動物細胞中以腺病我黃毒轉導Cre響應的FLEX基因表達調控開(kāi)關。FLEX 刀吧Cre-On系統利用位于目的基因兩(liǎng)側的Lox-變體重組位點，在C得飛re重組酶的調控下目的基因發(fā)銀得生反轉，目的基因正常表達；而C靜視re不存在的情況下，目的基因不表達。
FLEX Cre-On系統由兩(liǎng)對(duì)異型Lox-變體重子放組位點組成(chéng)，其中野生型序列稱爲LoxP，突變體稱爲月分Lox2272，分别位于反向(xiàng)基因ORF（相對(duì)啓動小化子方向(xiàng)而言）的兩(liǎn內雜g)側。 兩(liǎng)種(zhǒng)Lox-變信他體都(dōu)可被(bèi)Cre識别，但隻有相同的Lox飛鐘位點對(duì)可以彼此重組，與其他體讀Lox-變體不能(néng)進(jìn)行重組。 LoxP和Lox22從些72位點以交替方式位于ORF兩(liǎng)端，每對(duì科好)位點互爲反向(xiàng)。Cre重組酶不少雜存在的情況時(shí)，目的基因由于其編碼方向(x數又iàng)與啓動子方向(xiàng)相反去件，所以不發(fā)生表達；在Cre的存在下，LoxP和Lo腦山x2272位點對(duì)分别重組，導緻ORF方向(xiàng)反轉爲正向(生拿xiàng)，且其中的一對(d家秒uì)重組位點將(jiāng)具有相同的方向(xiàng)，Cre會(hu器舊ì)介導産生正向(xiàng)重組切割，繼而分别留下一個不同的重組位點。嗎章 ORF的方向(xiàng)反民著轉，使得目的基因可以在啓動子的驅動下正常表達。由于ORF側翼是又雨兩(liǎng)個不同的Lox-變體位點，所以即使存在Cre又能也不會(huì)進(jìn)一步樂放發(fā)生重組。
腺病毒載體首先是以質粒的方式構建并使用E. coli擴增，然後(hò業白u)線性化後(hòu)轉染進(jìn)入包還近裝細胞。在包裝過(guò)程中樹舊，位于兩(liǎng)個反向(xiàn從是g)重複序列（ITR）之間的DNA片段與由包裝細胞表達的病毒蛋白進(j我間ìn)一步包裝成(chéng)病毒顆粒。對(duì)于上述的FL新友EX介導的Cre-On條件性表達腺病毒載體，FLE讀自X Cre-On開(kāi)關位于兩(liǎng)房紙個ITR之間。當病毒轉導宿主細胞時(shí)，載體并以遊說麗離DNA的形式存在于細胞核中。
通過(guò)改造優化，我們的腺病毒載體缺失了E窗低1A、E1B和E3區，前兩(liǎng)者與病毒包裝相關（這(zhè技什)兩(liǎng)個基因已被(bèi)整合到包裝細胞的基因組中）。因此，運什錯用我們的病毒載體包裝出來的病毒是複制缺地相陷型的（隻能(néng)轉導靶細胞而不能(néng)自我河什複制），大大提高了生物安全性。
關于該載體系統的更多信息，請參考以下文獻。
| 參考文獻 | 主題 |
|---|---|
| Proc Natl Acad Sci U S A. 91:8802 (199山鐵4) | The 2nd generation北科 adenovirus vectors |
| J Gen Virol. 36:59 (19吃化77) | A packaging cell站廠 line for adenovirus vectors |
| J Virol. 79:5437 (2005)業件 | Replication-competent ade時討novirus (RCA) formation in 293 Cel爸西ls |
| Gene Ther. 3:75 (1996)土志 | A cell line for testing RCA錯校 |
| Gene. 216:55 (1花白998) | Characterization of LoxP mutan從開ts, including Lox2272 |
| Nat Biotechnol. 21:562 (2003) | Development of the FLEX swi著報tch system |
| J Neurosci. 28:7025 (2008)議女 | Application of a FLEX switch syste件吧m |
亮點
FLEX Cre-On條件性表達腺病毒載體專爲在哺乳動物細胞中實現高效的南街條件性基因激活表達而設計。目的基因剛開(kāi)始時(shí體紅)爲默認不表達，但是在Cre重組酶共表達的情況下將(jiāng)被(bèi)匠術激活表達，并且將(jiāng)反轉和改變目的基分子因的編碼方向(xiàng)。Cre存在的情況下，目的基去時因的表達受用戶自定義的啓動子的調控兵章。
該載體由血清型5（Ad5）腺病毒衍生而來。經(jīng草見)優化，該載體系統在大腸杆菌體内具有很高的拷貝數，包裝的活病毒具有很高的我飛滴度，對(duì)大多數宿主細胞具有高效的轉導能(né個雨ng)力，能(néng)有效地把載體整合到靶細胞基因組并實現外源基因的高拿什水平表達。
優勢
基因激活可控：目的基因ORF的反向(xiàng)放西水置，可防止基因發(fā)生洩漏表達。而某些條件性術校基因表達系統，如LoxP-Stop-LoxP表達載體系統，在某些志去情況下可能(néng)會(huì)有一我草些低水平的漏表達。
基因穩定激活：在Cre的存在下，LoxP和Lox2272位點對(duì)分别重組，時費導緻ORF方向(xiàng)永久性地反轉爲正向(xiàng冷內)，且其中的一對(duì)重組位點將(jiāng)具有相同的方向相劇(xiàng)，Cre會(huì)介導産生正向(x歌歌iàng)重組切割，繼而在ORF的兩(liǎng)端留下兩(liǎng)個不多服同的Lox-變體，即使存在Cre也不會(huì)進(jìn)一步發(fā草聽)生重組，使得目的基因可以在客戶定吧土制的啓動子驅動下正常表達。
對(duì)宿主基因組造成(chéng)破壞的低風險性：在轉導進(jìn)入靶細胞後(hòu)，腺病毒載體在細胞核很鄉保持著(zhe)遊離DNA的狀态，可以降低宿主基因組被(bèi)破壞而錯我緻癌的風險，使其成(chéng)爲人類體内實驗的理想載體。
超高病毒滴度：腺病毒可通過(guò)再次轉導包裝細胞而得到大量擴增，從而獲得超高滴度病綠國毒，慢病毒載體、逆轉錄病毒載體和AAV載體都(拿計dōu)不具有這(zhè)個特性。我們提供的腺病毒滴度可以達到>車拍;1012 VP/ml。
載體容量非常大：腺病毒能(néng)有效包裝的基因組上限大小是~38.7 林問kb（從5' ITR到3' ITR）。在除去腺病毒包裝表達所需主要元件所我裡占用的容量之後(hòu)，我們的載體具有不東約~7.5 kb的裝載空間以容納目的DNA（例如啓動子，ORF和熒光标記）。相好劇比起(qǐ)容量爲6.4 kb的慢病毒表達載體，腺病毒載體西店容量更大，能(néng)滿絕大多數應用要求。
宿主範圍廣泛：來源于人、小鼠和大鼠等常用哺乳動物細胞都(dōu)能(néng)被(廠車bèi)腺病毒載體轉導，但某些細胞類型則比較難轉導船舞（見下文不足之處）。
體内外實驗均有效：我們的載體不僅能(néng)用于體内活體動物訊信實驗，還(hái)具有體外細胞轉導能(néng近學)力。
安全性高：爲了确保腺病毒載體的生物安全性，我們的腺病毒載體缺失了病毒包裝所必須的基吧信因（這(zhè)些基因被(bèi)整合到包裝細胞的基因組）。 所以，利用我們草間的腺病毒載體包裝出來的病毒是複制缺陷型的，并且隻有在包裝細胞中呢制才具有複制能(néng)力。
不足之處
載體DNA非整合型：腺病毒基因組不會(huì)整合到靶細胞的基因組中，而是以遊離DN但女A的形式存在，并且随著(zhe)時(shí)間推移逐漸丢失，特别是在分裂細理服胞中。
難以轉導特定類型的細胞：雖然我們的腺病毒載體可以轉導很多類型的細胞包括非分裂細胞，但對明件(duì)某些特定類型的細胞如内皮細胞、平滑章時肌細胞、呼吸上皮分化細胞、外周血細胞、神經(jīng)元和造血幹細胞等，卻無熱中法進(jìn)行有效的轉導。
較強的免疫原性：活腺病毒會(huì)在動物體内引起(qǐ)強烈的免疫反應，從而限制了其人員在體内的某些應用。
技術複雜：使用腺病毒載體時(shí)，需要在包裝細胞中産生活病毒，然後(h熱火òu)測定病毒滴度。這(zhè)些聽年過(guò)程技術難度更高，周期更長(cháng吃見)。
載體關鍵元件
5' ITR: 5' inverted terminal repeat. In 為關wild type virus, 5' ITR and 3' ITR a也視re essentially identical in sequence書睡. They reside on two ends of the vir得藍al genome pointing in opposite di為票rections, where they serv工光e as the origin of viral genom空厭e replication.
Ψ: Adenovirus packagi有大ng signal required for the packa笑醫ging of viral DNA into virus金大.
Promoter: The promoter driving your gene o公懂f interest is placed her件照e.
Lox2272: Recombination site for Cre recombinas多美e. Mutated Lox si上資te with two bas草厭e substitutions of wild type LoxP. In麗些compatible with LoxP 男鐘sites. When Cre is present, th河務e LoxP and LoxP2272 sites will 計鄉be cut and recombine with com線白patible sites.
LoxP: Recombination site for見輛 Cre recombinase. Incompa又媽tible with Lox2272 sites好體. When Cre is present, t開作he LoxP and Lox2272 sites w家行ill be cut and reco離喝mbine with compatible s身體ites.
ORF: The open readin就請g frame of your gene of i美小nterest is placed here,科路 in a sense orie校內ntation.
Kozak: Kozak consensus sequence. It is p服資laced in front of the start codon 拿校of the ORF of interest because吧很 it is believed to facilitate tr筆秒anslation initi自你ation in eukaryotes.
TK pA: Herpes simplex virus thymidine kinase水從 polyadenylation signa公家l. It facilitates 電路transcriptional termination of the upst工在ream ORF.
ΔAd5: Portion of Ad5放購 genome between the two ITRs minus 唱司the E1A, E1B and E3 regions.
3' ITR: 3' invert用文ed terminal repeat.
pBR322 ori: pBR322 origin of replicati子雪on. Plasmids carrying 厭大this origin exist in medi討要um copy numbers in E. col遠兵i.
Ampicillin: Ampicillin resistance gene. It a唱下llows the plasmid to be maintained b答工y ampicillin selection i關火n E. coli.
PacI: PacI restriction site (PacI 睡長is a rare cutter 她費that cuts at TTA弟兵ATTAA). The two PacI restriction動少 sites on the vector can be use劇學d to linearize the vector an資著d remove the vector back技弟bone from the viral sequence, which去匠 is necessary for efficient packagin風微g.
哺乳動物基因FLEX條件性表達腺病毒司間載體（Cre-On）
概述
FLEX介導條件性表達腺病毒載體結合就了了載體家的高效的腺病毒載體系統和Cre響應的F小讀LEX條件性基因表達載體，可以幫助您實現在多種(zhǒng)中員多樣(yàng)的哺乳動物細胞中以腺線在病毒轉導Cre響應的FLEX基因表達調控開(kāi)關。F輛下LEX Cre-On系統利用位于目的基因兩(liǎng)側的Lox我生-變體重組位點，在Cre重組酶的調控下目的基因發(fā)生反轉，討冷目的基因正常表達；而Cre不存在的情況下，目黃大的基因不表達。
FLEX Cre-On系統由兩(liǎng木路)對(duì)異型Lox-變體重組位點組成(chéng)，其中野好金生型序列稱爲LoxP，突變體稱妹呢爲Lox2272，分别位于反向(xiàng)基因ORF（愛了相對(duì)啓動子方向(xiàng)房線而言）的兩(liǎng)側。 兩(liǎng)種(zhǒng)Lox近工-變體都(dōu)可被(bèi)Cre識别，但隻有相同的Lox鄉了位點對(duì)可以彼此重組，與其他Lox-我志變體不能(néng)進(jìn)行重組。 LoxP和Lox2低唱272位點以交替方式位于ORF兩(liǎng)端，每對(duì)位點互爲反向(子睡xiàng)。Cre重組酶不存在的情況時(shí)，目的基因由于其編碼船技方向(xiàng)與啓動子方向(xiàng)相反，所以不發(fā)生表達；在場書Cre的存在下，LoxP和Lox睡書2272位點對(duì)分别重組，導緻ORF方向(xi小路àng)反轉爲正向(xiàng)，資習且其中的一對(duì)重組位點將(j這綠iāng)具有相同的方向(xiàng)，Cre會(hu妹吃ì)介導産生正向(xiàng)重組切割，繼而分别留下一個志會不同的重組位點。 ORF的方向(xiàng)反轉，使得目的基因可以在啓兵文動子的驅動下正常表達。由于ORF側翼是兩(liǎng)友弟個不同的Lox-變體位點，所以即使存在Cre也不會(huì)進(知木jìn)一步發(fā)生重組。
腺病毒載體首先是以質粒的方式構建并使用E. coli擴增，然後(章大hòu)線性化後(hòu)轉染進(jìn)低弟入包裝細胞。在包裝過(guò)程中，位于兩(liǎng)個反向(睡器xiàng)重複序列（ITR）之間的作制DNA片段與由包裝細胞表達的病毒蛋白進下放(jìn)一步包裝成(chéng)病毒顆粒。對(du放如ì)于上述的FLEX介導的Cre-On條件性表達腺病拿上毒載體，FLEX Cre-On開(kāi)關得白位于兩(liǎng)個ITR之間。白月當病毒轉導宿主細胞時(shí)，載體并以遊離DNA的形式存線內在于細胞核中。
通過(guò)改造優化，我們的腺病毒紙吃載體缺失了E1A、E1B和E3區，前兩(li煙問ǎng)者與病毒包裝相關（這(zhè)兩(liǎng)個基因已被(bè間劇i)整合到包裝細胞的基因組中）。因此，運用我們的病毒載體包裝出來的病毒可員是複制缺陷型的（隻能(néng)轉導靶細胞而不能(néng)自我複制），大機個大提高了生物安全性。
關于該載體系統的更多信息，請參考以下文獻。
| 參考文獻 | 主題 |
|---|---|
| Proc Natl Acad Sci U S樂坐 A. 91:8802 (1994) | The 2nd generation adenov新從irus vectors |
| J Gen Virol. 36:59 (1977) | A packaging cell line for adenovir也友us vectors |
| J Virol. 79:5437 (2005)東爸 | Replication-competent大件 adenovirus (RCA) f自很ormation in 293 Cells |
| Gene Ther. 3:75 (1996) | A cell line for testing RCA |
| Gene. 216:55 (1998)愛體 | Characterization of Lox線知P mutants, including Lox2272 |
| Nat Biotechnol. 21:562 (2003區明) | Development of t學道he FLEX switch system |
| J Neurosci. 28:7025 (20見個08) | Application of a FLEX switch sy木醫stem |
亮點
FLEX Cre-On條件性表達腺病毒載體專爲在哺乳動物細胞中實現高明議效的條件性基因激活表達而設計。你制目的基因剛開(kāi)始時(shí)爲默認不表達，但是在C國說re重組酶共表達的情況下將(jiāng)被(bèi)激活表達，并且將(jiān下謝g)反轉和改變目的基因的編碼方向(xiàng)。Cre存在的風家情況下，目的基因的表達受用戶自定義的啓動子的調控。
該載體由血清型5（Ad5）腺病毒衍生而來。輛媽經(jīng)優化，該載體系統在大腸杆菌體内具有很高的拷貝數，包裝的活討場病毒具有很高的滴度，對(duì)大子機多數宿主細胞具有高效的轉導能(néng)力，能(néng)有效地把載體整書唱合到靶細胞基因組并實現外源基因的高水平表達。
優勢
基因激活可控：目的基因ORF的反向(xiàng朋你)放置，可防止基因發(fā)生洩漏表達。而某些條件性基因話村表達系統，如LoxP-Stop-LoxP表達載體系統，在某些情況下可能(月少néng)會(huì)有一些低水平的漏表達。
基因穩定激活：在Cre的存在下，LoxP和Lox2272位點對(duì)分别重信見組，導緻ORF方向(xiàng)永久性地反轉爲正向(xiàng)，且黃電其中的一對(duì)重組位點將(j有日iāng)具有相同的方向(xiàng)，Cre會(huì)介導産生正向(xi老化àng)重組切割，繼而在ORF的兩(liǎng)端留下兩讀熱(liǎng)個不同的Lox-變體樹來，即使存在Cre也不會(huì)進(jìn)一步發(fā)生重組開購，使得目的基因可以在客戶定制的啓動子驅動下正化煙常表達。
對(duì)宿主基因組造成(chéng微筆)破壞的低風險性：在轉導進(jìn)入靶細胞後(hòu)，腺病毒載體內煙在細胞核保持著(zhe)遊離DNA的狀态，可以降低宿主基因組被(bèi)破拿物壞而緻癌的風險，使其成(chéng)爲人類體内實驗的理想載體。
超高病毒滴度：腺病毒可通過(guò)再次轉導包裝細胞而得到大量擴增，從而獲得超高滴度病毒學呢，慢病毒載體、逆轉錄病毒載體和AAV載體都(dōu)不具有這(zhè)個地快特性。我們提供的腺病毒滴度可以達到>10能河12 VP/ml。
載體容量非常大：腺病毒能(néng)有效包裝的基因組上限大小是~38.7 kb（從5'門腦 ITR到3' ITR）。在除去腺病毒包裝表達所需主要元件所占用算鐘的容量之後(hòu)，我們的載體具有約~7.5 k你秒b的裝載空間以容納目的DNA（例嗎快如啓動子，ORF和熒光标記）。相比起聽暗(qǐ)容量爲6.4 kb的慢病毒表達載體，腺病毒載頻費體容量更大，能(néng)滿絕可那大多數應用要求。
宿主範圍廣泛：來源于人、小鼠和大鼠等常用哺乳動物細胞都(dōu)現工能(néng)被(bèi)腺病毒載體轉導，但某些細胞類型則比較難轉導（見下話少文不足之處）。
體内外實驗均有效：我們的載體不僅能(néng)用于體内活體麗技動物實驗，還(hái)具有體外道爸細胞轉導能(néng)力。
安全性高：爲了确保腺病毒載體的生物安全性，我們的腺病毒載體缺失放拍了病毒包裝所必須的基因（這(zhè)些基因被(bèi)整合到包裝細胞的對劇基因組）。 所以，利用我們的腺病毒載體包裝出來的病毒是複制缺陷型的，并且化藍隻有在包裝細胞中才具有複制能(néng)力。
不足之處
載體DNA非整合型：腺病毒基因組不會(huì)整合到靶細胞的基因組中，而是以遊離DNA的形式存在大月，并且随著(zhe)時(shí)間推移逐漸丢失，特别是在分裂細胞中。志在
難以轉導特定類型的細胞：雖然我們的腺病毒載體可以轉導很多類型的細胞包括非分裂慢業細胞，但對(duì)某些特定類型的細胞如内皮細胞、平滑肌細胞、呼月房吸上皮分化細胞、外周血細胞、神經算制(jīng)元和造血幹細胞等，卻無法進(jìn)行有土又效的轉導。
較強的免疫原性：活腺病毒會(huì)在動物體内引起(qǐ輛哥)強烈的免疫反應，從而限制了其在船快體内的某些應用。
技術複雜：使用腺病毒載體時(shí)，需要鐵遠在包裝細胞中産生活病毒，然後(hòu)測定病毒滴度。這街站(zhè)些過(guò)程技術難度更高，周期腦地更長(cháng)。
載體關鍵元件
5' ITR: 5' inverted terminal repeat. In wild ty這數pe virus, 5' ITR 師作and 3' ITR are essentially identic說多al in sequence. They 睡民reside on two ends of th這話e viral genome pointing體海 in opposite dire內我ctions, where they年動 serve as the origin of viral 麗學genome replication.
Ψ: Adenovirus packaging signal 理她required for the packa嗎吧ging of viral DNA&n西家bsp;into virus.
Promoter: The promoter driving your gene of i腦民nterest is placed here.
Lox2272: Recombination site for Cre re醫藍combinase. Mutated Lox s筆些ite with two base 東術substitutions of wild type LoxP.東老 Incompatible with LoxP si拿風tes. When Cre is present, the LoxP a歌水nd LoxP2272 sites wil機子l be cut and recombi都站ne with compatible sites.
LoxP: Recombination site for C在些re recombinase. Incompatible wi光科th Lox2272 sites. When Cre is p得制resent, the LoxP and Lox2理看272 sites will 生頻be cut and recombine with 場短compatible sites.
ORF: The open reading frame of y新弟our gene of inter志厭est is placed here, 音唱in a sense orientation.聽妹
Kozak: Kozak consensus sequence. It is plac理著ed in front of the start codon 會吃of the ORF of interes車樂t because it is believed t生外o facilitate transl他大ation initiation in e裡外ukaryotes.
TK pA: Herpes simplex virus thymidine kinase p師器olyadenylation signa有藍l. It facilitates transcriptio少妹nal termination of the upstream ORF.
ΔAd5: Portion of A紙高d5 genome between t服上he two ITRs minus the E1A, E1B and問大 E3 regions.
3' ITR: 3' inverted t紅木erminal repeat.
pBR322 ori: pBR322 origin of replication. Plasmi數的ds carrying this origin 遠土exist in medium copy numbers 都腦in E. coli.
Ampicillin: Ampicillin resistance g又水ene. It allows the plasmid to be mai去金ntained by ampicillin selection in習西 E. coli.
PacI: PacI restriction 東服site (PacI is a有長 rare cutter that cuts 相化at TTAATTAA). The two PacI restr體紅iction sites on the vector can be 知近used to linearize the vector 樂低and remove the vector back唱機bone from the viral sequence, w嗎相hich is necessary 離子for efficient packag秒車ing.