AAV衣殼定向(xiàng)進(jìn)化

重組AAV病毒由于其多樣(yàng)的組織嗜性、長(chá還近ng)時(shí)間的轉基因表達效果、少照非緻病性以及低免疫原性等特點，作爲一種(zhǒng)基因遞送載體被信可(bèi)廣泛用于基因治療和疫苗開(kāi)發(fā)。

既有的AAV血清型存在一定的問題影響了理短其用于基因治療的潛力。首先，盡管現有的血志紙清型提供了一系列組織嗜性以供選擇，但是在臨床應用上仍爸看然具有一些類型的組織是這(zhè)些血清型的特異性無法覆蓋的。作用第二，盡管一些特定血清型的AAV可特異感染靶組織，但是其基因遞大章送效率可能(néng)偏低，或者具有脫靶效應感染其他組織。第下子三，體内預先存在針對(duì)多種公腦(zhǒng)AAV血清型的中和抗體將(體裡jiāng)從一開(kāi)始或者多次給藥後(hòu)阻礙新醫AAV的感染。最後(hòu)，一些AAV血清型類型相比其它類型更難在生産中獲國雨得高的滴度、純度和穩定性。爲克服這(zhè)些問題，AA化紅V衣殼開(kāi)發(fā)在加學線速獲得新型AAV突變體、改善AAV性能(néng)方面(miàn)一直是相事理當重要的技術。

定向(xiàng)進(jìn)化是一種(zhǒng)常用于冷影提高生物大分子性能(néng)的高通量方法。該方法模拟自然選擇過(g慢內uò)程并將(jiāng)其所耗時河友(shí)間大幅縮短。AAV衣殼定向(xiàng)進(jìn)化通過短河(guò)突變野生型AAV衣殼基因短為，獲得具備高度多樣(yàng)性的AAV衣殼文庫，然後(hòu)從中篩選出全新外微的、性能(néng)更優越的AAV衣殼。由于定向(xiàng)東錯進(jìn)化不需要具備蛋白結構與功能(néng)相關的西門先驗知識，因此在新型AAV衣殼開(體商kāi)發(fā)上相對(duì)于理論設計方式更具優勢。和懂

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服務亮點

• 全方面(miàn)的服務平台：載體家是當前全球唯一一家具備A員章AV臨床前、臨床CRO和CDMO一站式服務的企業飛爸。我們的AAV相關服務涵蓋載體設計、載體優分看化、載體克隆、文庫構建、病毒包裝、衣殼定向(xiàng)進(jìn)化和工哥鄉程改造、AAV組織分布鑒定、GMP病毒生産等。
• 多策略定向(xiàng)進(jìn)化構建衣殼高度多樣(yà火化ng)性的病毒文庫：我們在文庫構建方面(miàn)視老的豐富經(jīng)驗，可以幫助您通過(guò)定向(xiàn務雜g)進(jìn)化以及其結合方法進(jìn)行自定義設愛問計，以獲得極具病毒衣殼多樣(yà北鐵ng)性的文庫。
• 文庫病毒高滴度包裝：我們可使用一步法或兩(liǎng)步法包裝文庫動還病毒，并保證每種(zhǒng)衣殼或基因理哥組發(fā)生突變的病毒均具有很高的滴度。
• 使用包括非人靈長(cháng)類（Non-human primat舞微e，NHP）在内的多種(zhǒng)模式生物間木進(jìn)行體内篩選：除了進(jìn)行體外篩選，我們還(hái)提供一系列模錯員式生物用于進(jìn)行體内篩選，如小和坐鼠、大鼠、以及重要的兩(liǎng)種路秒(zhǒng)非人靈長(cháng)類：食蟹猴（Macaca fasci風作cularis）和猕猴（Macaca Mulatta）。如亮所有體内篩選試驗均在經(jīng)過(guò)AAALAC認證的機構中以專業聽門認可的方式進(jìn)行。
• 完善的技術支持：我們的科學(xué)家在AAV衣殼開(kāi)發(事新fā)項目上具有深厚的經(jīng)驗，能(nén銀村g)夠爲您提供全面(miàn)的技術支持，包括從文庫設計、她用文庫構建到體内篩選以及NGS分析。

衣殼進(jìn)化和篩選流程

實施AAV衣殼定向(xiàng)進(jìn)化的第一步也是離化最關鍵一步是制備高度多樣(yàng)性的AAV轉移載樹草體文庫，每個載體上包含一個嵌合型AAV基因組：含有一個rep基因和一個綠暗突變cap基因。現今已有多種(zhǒng)方式可以高費樹效制備這(zhè)種(zhǒng)突變cap基因，比如易錯PCR（Erro區亮r-prone PCR）、随機多肽展示（影學Random peptide display白工）、家族DNA洗牌（DNA fa文什mily shuffling）、以及計河機算機設計（In silico d放頻esign）等。轉移載體被(bèi)包裝成(chéng)病毒顆粒，每個病器謝毒顆粒的基因組包含一個突變cap基因。文庫中這(zh舞錢è)些混雜的嵌合型病毒随後(hòu)被(bèi)篩選并測試以下方面(mi吃習àn)：一、高效轉導特定組織或器官的靶細胞；二、高度親和細胞特異性表面(mià呢北n)受體；三、能(néng)夠逃避中和抗體。經(jīng)過購看(guò)篩選後(hòu)的的玩報病毒基因組從靶細胞中複原，然後(hòu)被(bèi)用于構計拍建一個新的更小的文庫用于第二輪篩選，費是并在多個篩選周期後(hòu)得到某種(zhǒng)富集的突民睡變型衣殼。該基因克隆經(jīng)過(guò)鐵來驗證即認爲發(fā)現了一種(zhǒng)海紅新型的具有更強性能(néng)的變異AAV衣殼（圖1）。可什

圖1 AAV衣殼定向(xi頻新àng)進(jìn)化的典型篩選流程山新

定向(xiàng)進(jìn)化構建衣殼文庫

以下策略常用于制備突變型AAV衣殼。用于篩選的木風衣殼文庫通過(guò)大規模并行克隆AAV載體獲得南海。這(zhè)些載體均包含了嵌合型的A你畫AV基因組（每個載體包含一個rep基因和一個突變cap一吧基因）。

易錯PCR

易錯PCR是最直接用于開(kāi)發(fā)高度多樣(yàng)化的A地很AV衣殼的選擇，這(zhè)其中包明金括從修改标準PCR方法到突變AAV衣殼基因等多種(zhǒng畫很)方式。更具體而言，易錯PCR結合了多種(章訊zhǒng)次優化的PCR條件，如使用低保電兒真性聚合酶、更長(cháng)的延伸時(shí)間、更高的Mg²⁺濃度、添加Mn²⁺，以及使用不相等的多種(zhǒng)d南讀NTP濃度等方式來對(duì)AAV衣殼基因引入随機突變。

随機多肽展示

随機多肽展示通常使用7到9個随機多肽序列插入到AAV衣殼蛋白序列的特定了音位點，以達到改變病毒與特定細胞表面(亮微miàn)受體的天然相互作用的目的。插入的多肽一般位于AA裡得V衣殼暴露此段多肽的位置或者介導病毒與細胞相互作用的關鍵位置。例如司輛，AAV2衣殼蛋白的587位到588位氨基酸（位于V資得RIII可變區）是一個适用于AAV2多肽展示文庫的插入位睡科點。在此位點插入多肽可以阻礙與AAV2作用的硫酸類肝素多糖蛋白（He林事paran sulfate proteogly明體can, HSPG）模體的功能(néng)（HSPG是識别A答照AV2的主要細胞表面(miàn)受體），并促進(jìn)展示的多肽與細胞化嗎表面(miàn)分子相互作用。

家族DNA洗牌

家族DNA洗牌是一種(zhǒng)近玩通過(guò)不同AAV血清型的親本衣殼基因分子雜交産生嵌合AAV衣殼的高效門南方法。爲了實現這(zhè)一點，將(你匠jiāng)不同AAV血清型的親本衣殼基因碎片化，然後土那(hòu)通過(guò)無引物PCR利用部分序列同源性將外是(jiāng)其重組爲新型AAV衣殼。作爲一種(z如喝hǒng)替代策略，還(hái)可以通過(guò)綜合洗牌法與其他設計方弟章法創建高複雜性的文庫，即將(jiāng)很秒理論設計（基于AAV生物學(xu多拿é)的先驗知識修改衣殼序列）與定向(xiàng)進(jìn)化小喝相結合。在這(zhè)種(zhǒng)方法中，爲發(fā)現和評估适合進是科(jìn)行突變的衣殼位點，將(jiāng)首你分先對(duì)天然血清型的AAV衣殼的精細結構和序列進(jìn)行兵坐分析。這(zhè)些含有突變的基因碎片最後(hòu)將(jiāng)合能算成(chéng)爲全長(cháng)序列，并用于組裝新型AAV衣殼。

計算機設計

現今已有多種(zhǒng)計算機自喝方法可用于預測促使AAV性能(néng)得到加強麗匠的衣殼序列。其中一個常用的方法是祖先衣殼重建，涉及多兵間個計算機設計的祖先AAV衣殼文庫的構建，然從懂後(hòu)進(jìn)行實驗驗證以發(fā)現組織嗜性得到改進(jìn)還讀的衣殼序列。該方法背後(hòu)的機理在于經(jīng)自然選擇爸拿留下的AAV進(jìn)化中間體大概率上已錯就演化出獨特的性狀，并且仍然能(néng)維持病毒的結構和功能(néng)。另的物一方面(miàn)，機器學(xué)習則是另一種(zhǒng)廣泛使用嗎近的計算機設計方法，根據輸入的大量蛋白質結構與功能(河鐘néng)的關系數據來預測新型AAV病毒衣殼的組裝國書。

衣殼文庫的病毒包裝

衣殼文庫的病毒包裝可以劃分爲一步遠議法或者兩(liǎng)步法，如下所嗎她述：

一步法包裝衣殼文庫

包裝AAV衣殼文庫的傳統方法是采用一步法：衣殼森可文庫和腺病毒輔助質粒共轉染包裝細胞。雖然這(zhè)種(zhǒng)方法被愛音(bèi)廣泛使用，但它确實存在交叉包裝（具讀筆備衣殼變異體的AAV顆粒其基因組報西和衣殼類型不匹配）和衣殼鑲嵌（AAV醫民的衣殼組分來源于多種(zhǒng)變異體）的缺點。爲了克服資自這(zhè)些問題，建議以極低物靜的文庫質粒數/細胞數比率轉染包裝細胞，以确保每個細胞至多吸收一個文庫質粒雪民。

兩(liǎng)步法包裝衣殼文庫

在兩(liǎng)步法包裝中，衣殼文庫首先與編碼野生型衣殼基因但缺少來店病毒ITR的輔助質粒共轉染至包裝細胞中。這(zhè紅空)將(jiāng)産生帶有鑲嵌型衣殼的AAV顆粒，這(zhè)種(文妹zhǒng)部分由野生型VP蛋白組成(chéng)的衣殼被(bèi)稱些金爲AAV轉移穿梭機（AAV transfer shuttle）算去。將(jiāng)此種(zhǒng)A錢化AV以低感染複數轉導包裝細胞，以實現每個細胞至多靜術感染一個病毒顆粒。随後(hòu)用野生型腺病毒對(duì)包裝細胞進(jìn冷亮)行雙重感染，最終産生高滴度病毒妹討衣殼文庫。

體外與體内文庫篩選

爲獲得帶有期望性狀的嵌合型AAV，根據篩選目的病毒衣殼務又文庫通常需要經(jīng)過(guò)在體外或者體内的多次篩選：

體外篩選

利用已建立的細胞系篩選AAV衣殼文庫是一種(z花報hǒng)常用的體外篩選方法，特别是用于發(fā)現靶向睡師(xiàng)受體能(néng)力發(fā)生變化的衣電空殼突變型AAV。AAV文庫的體外篩選快速且技術簡單，但是也存在什什一定的問題。首先，針對(duì)體外高轉導效率優會費化的載體在體内使用時(shí)可能(néng)無法重器拍現相同的效率。其次，在體外表現出對(人廠duì)靶細胞高度特異性的AAV載體在體内時(shí)可能(néng)會子她(huì)轉導非靶組織。體外篩選AAV文庫的另小算一種(zhǒng)策略是在感染靶習制細胞之前，將(jiāng)AAV文庫加入免疫動物的強效血清遠費中以辨别具有免疫逃避屬性的突變型衣殼。然而，在體内實驗時(shí)衣殼突變的草話AAV引發(fā)免疫反應類型可能(né弟商ng)并不一緻（即使同樣(yàng)的AAV載體，通過(guò)不同途徑輸送也厭內可能(néng)會(huì)産生不同的免疫反應但些）。

體内篩選

體内動物模型爲篩選AAV文庫提供了更可靠的平台，特别是用于尋動離找那些需要轉導體外難以培養的細胞歌草的或者需要轉導複雜組織結構中的特定細胞的AAV突變好明體。體内篩選還(hái)有助于發(fā)現與AAV突變體相關的任家小何的潛在脫靶效應。小鼠和NHP均廣泛這人用于AAV文庫的體内篩選，但是NHP模型由于與人類的高度相似，理在因此是篩選與臨床應用相關的改良型AAV載體的麗請最佳平台。