哺乳動物Cas9表達腺病毒載體

概述

CRISPR/Cas9（規律成司北(chéng)簇的間隔短回文重複序列及相關蛋白9）核樂動酸酶表達載體屬于幾種(zhǒng)新興的基因組編輯工具之用公一（另外兩(liǎng)種(zhǒng)是ZFN和TALEN），可在基因組的要黑靶位點快速有效地産生突變。這(zhè)些質粒載體編碼的特異性RNA，能(n喝大éng)夠引導DNA核酸酶（或缺刻酶）編輯基因組中特定位點的DNA長少序列。

Cas9是RNA引導DNA核酸酶，是們風天然原核免疫系統的一部分，賦予細菌産生對(duì)質鐵樹粒和噬菌體等外源遺傳物質的抵抗能(néng)力。在細胞内，Cas9購知核酸酶與引導RNA（gRNA）形成(chéng)複合物，該複合物通過(guò)愛道與基因組中的18-22nt的同源靶序列直接相互作用，gR好體NA與靶位點通過(guò)互補配對(duì)使Cas農內9定位到靶序列上，然後(hòu)切割基因組中的靶位點。海雪

使用CRISPR打靶目的基因需店店要目标細胞同時(shí)表達Cas9和土務特異gRNA。這(zhè)可以通過(guò)在同一個載體上共表達C外鄉as9和gRNA，也可以通過(guò我業)在兩(liǎng)個載體各上自表達Cas要鄉9和gRNA來實現。使用Cas9和gRNA兩(liǎng)個載體分開(k計友āi)表達的優勢在于可使用不同的gRNA與不同的Cas9變體組合（如野生在民型Cas9，Cas9n，dCas9工制），從而根據實驗目的帶來更多變的實驗方案。

Cas9表達腺病毒載體系統可以有效地在多數哺乳動物細胞中表達Cas9蛋白，但是老鐵其載體爲遊離形式存在于細胞中，不整合宿主基因組。腺病玩理毒常用于體内基因轉導，以及基因治療和疫苗研究領域。

Cas9表達腺病毒載體首先以質粒的方式構建并使用E. coli擴增，然後(h看那òu)轉染進(jìn)入包裝細胞。在包裝過(guò)程中，位于兩(liǎng老員)個反向(xiàng)重複序列（南中ITR）之間的DNA片段與由包裝細胞表達的病毒蛋白進(jìn)一步包哥弟裝成(chéng)病毒顆粒。當病毒轉導宿主細胞時(shí)，載山明體并以遊離DNA的形式存在于細胞核中我來。兩(liǎng)個ITR區域之間的Cas9基因和其他病毒基因組分由上得此進(jìn)入了細胞。

通過(guò)改造優化，我們的腺病毒載體缺失了E1A、E1B和E3區，前兩(l答雜iǎng)者與病毒包裝相關（這(zhè)兩(liǎng)個基因已被(b離跳èi)整合到包裝細胞的基因組中）。因此，運用我們的病毒載體包裝拍房出來的病毒是複制缺陷型的（隻能(néng)轉導靶細胞而不能(néng)自我複林可制），大大提高了生物安全性。

我們提供多種(zhǒng)版本的來源于Streptococc街外us pyogenes的SpCas9。這(樂著zhè)其中包括hCas9，人源化的野生型SpC紙黑as9，能(néng)有效地在靶序列制造DNA大山雙鏈斷裂（DSB）；hCas9-DA10呢拍，核酸酶突變型的人源hCas9，動呢隻對(duì)靶序列的DNA單鏈造成(好電chéng)切口；dCas9，bao'hanD10A和H84了懂0A突變，屬于無核酸酶活性的SpCas9；SpCas9-HF1，親和們光性強化的SpCas9；以及eSpCas9，特異性強化的SpCas9。dC冷廠as9融合轉錄激活結構域如dCas9/VP64和dCas9/VPR，或者司中融合轉錄抑制結構域後(hòu)，如dCa地南s9/KRAB，可分别應用于CRISPRa和CRISPRi系統。此外，我們提供樹小的來源于Staphylococcus aure明志us的SaCas9，其序列要比SpCas9樂行和來源于Acidaminococcus的AsCpf事飛1更短（AsCpf1屬于新一代CRIS日北PR基因編輯系統。AsCpf1造成(chéng)DS生店B時(shí)，兩(liǎng)條DNA鏈上的做章切口位置相互錯開(kāi)，形成(chéng)粘性拿站末端）。

關于該載體系統的更多信息，請參考以下文獻。

參考文獻	主題
Science. 339:819 (2013)	Description of genome editing市子 using the CRISPR/Cas9 system不長
Nat. Biotech. 31:827 (2013)土都	Specificity of RNA-g房視uided Cas9 nucleases
Nat. Commun. 9:1911 (2018)	Review on various Cas9 訊場variants
Sci Rep. 4:5105 (20報商14)	CRISPR/Cas9 targeti地地ng by adenoviral vectors

亮點

我們的Cas9表達腺病毒載體由血清型5（Ad5）腺病毒衍生而來。經(j音紙īng)優化，該載體系統在大腸杆菌體内具有很高的拷貝數，包裝的活病毒具有很高的冷男滴度，對(duì)大多數宿主細胞具冷站有高效的轉導能(néng)力，能(néng)有下物效地把載體整合到靶細胞基因組并實現外源基因的高農謝水平表達。Cas9表達腺病毒載體可實現用戶自定義啓動子驅開木動下的高水平Cas9表達。我們可提供多種(zhǒng)類型的C站黑as9蛋白以滿足不同的實驗需求。

優勢

靈活性：單Cas9表達載體可以與多個不同的gRNA共轉染靶細胞打靶多個位點。此外，鐵服單Cas9表達載體可以通過(gu近些ò)慢病毒轉導構建穩轉細胞株。經(j化綠īng)FACS或抗生素篩選後(hòu)，Cas9高水技厭平表達的穩轉細胞株可被(bèi)用來接受gRNA轉染從而獲得高效的打靶玩舞率。

對(duì)宿主基因組造成(chéng)破壞的低風險性：在轉導進(jìn)入靶細胞後(hò為房u)，腺病毒載體在細胞核保持著(zhe)遊離DNA的狀态，可以降低熱對宿主基因組被(bèi)破壞而緻癌的風險，使其成(chén相區g)爲人類體内實驗的理想載體。

超高病毒滴度：腺病毒可通過(guò)再次轉導包裝細胞而書多得到大量擴增，從而獲得超高滴度病毒，慢病毒載體、逆轉錄病毒載體線畫和AAV載體都(dōu)不具有這(體機zhè)個特性。我們提供的腺病毒吃地滴度可以達到>10¹² VP/ml。

宿主範圍廣泛：來源于人、小鼠和大鼠等常用哺乳動物細胞都(dōu)能(néng)被(中湖bèi)腺病毒載體轉導，但某些細胞類型則比較難為個轉導（見下文不足之處）。

體内外實驗均有效：我們的載體不僅能(néng)用于體内活體動物實驗，還(hái)具有體外細胞遠可轉導能(néng)力。

安全性：爲了确保腺病毒載體的生物安全性，我們的腺病毒低習載體缺失了病毒包裝所必須的基因（這(zhè)些基因被(bèi)國呢整合到包裝細胞的基因組）。所以，利用我家坐們的腺病毒載體包裝出來的病毒是複制缺陷型的，并且隻有在包裝細胞中才具有複制能員謝(néng)力。

不足之處

載體DNA非整合型：腺病毒基因組不會(huì)整合到靶細胞身開的基因組中，而是以遊離DNA的形式存在，很愛并且随著(zhe)時(shí)間推移逐漸丢失，特别是在分裂細胞中。行黃

難以轉導特定類型的細胞：雖然我們的腺病毒載體可以轉導很多類拍也型的細胞包括非分裂細胞，但對(duì)購音某些特定類型的細胞如内皮細胞、平滑可讀肌細胞、呼吸上皮分化細胞、外周血細胞、神經(jīn雪畫g)元和造血幹細胞等，卻無法進(jìn)票中行有效的轉導。

較強的免疫原性：活腺病毒會(huì)在動物體内引起(qǐ)強烈的免疫反應，從而限制了員劇其在體内的某些應用。

技術複雜：使用腺病毒載體時(shí)，需要在包裝細胞中産生活病毒，然後時能(hòu)測定病毒滴度。因此腺病毒轉染相對(duì)于常年商規質粒轉染，技術難度更高，周期更長(cháng)。通過(guò)選女嗎擇我們xia病毒包裝服務可以有效縮短包裝周期。

PAM序列依賴: CRISPR/Cas9靶向(xiàng)舊資特定位點時(shí)對(duì)呢務gRNA識别序列3'端的PAM序列有嚴格要求。不同類型的Cas9蛋白需愛裡要使用不同的PAM序列。

載體關鍵元件

5' ITR: 5' inverted terminal一謝 repeat. In wild ty我短pe virus, 5' ITR and 3' ITR are essenti在章ally identical 風讀in sequence. They reside on two en很我ds of the viral genome pointing話弟 in opposite directions,電年 where they serve a工風s the origin of請技 viral genome replication.

Ψ: Adenovirus packaging sig藍鄉nal required for the packaging of vi火子ral DNA into virus.土相

Promoter: The promoter that drives the 開女expression of the downstre對謝am Cas9 gene is place好吧d here.

Kozak: Kozak consensus sequence. 花刀It is placed in fron外事t of the start codon of 新放the ORF of interes錢服t because it is believed t去老o facilitate tr遠化anslation initiation in eukaryotes.

ORF: The open reading frame of t生購he Cas9 nuclease varia對很nt chosen by the user.

TK pA: Herpes simplex virus thymidin要吃e kinase polyadenylation sig音樹nal. It facilitates transcriptional t那車ermination of the upstream 喝鐘ORF.

ΔAd5: Portion of Ad5 genome bet農業ween the two ITRs minus the E1A, E1自子B and E3 regions.

3' ITR: 3' inverted t制議erminal repeat.

pBR322 ori: pBR322 origin of 車來replication. Plasmids ca媽子rrying this origin exist 市見in medium copy numbe地家rs in E. coli.

Ampicillin: Ampicillin 照空resistance gene. It allows the plasmid 多那to be maintained by ampici會司llin selection in 坐化E. coli.

PacI: PacI restriction site (Pa兵刀cI is a rare cutter that 事嗎cuts at TTAATTAA). The two P路書acI restriction s相自ites on the vector can be 件坐used to linearize th文要e vector and remove the vector backbo男一ne from the viral離章 sequence, which is ne外睡cessary for efficient packagin劇頻g.

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