哺乳動物miR30-shRNA幹擾慢病毒載體

概述

慢病毒miR30 shRNA幹擾載體遠藍系統是用于多種(zhǒng)哺乳動物細胞海醫中，高效幹擾靶基因表達的方法。當病毒基因組被(bèi)逆轉錄并永久整合到宿主靜事細胞基因組時(shí)，用戶定制的吧厭啓動子會(huì)驅動包含目的基紙南因和一個或多個基于miR30的靶向(xiàng)目的基因的shRNA（什謝shRNAmiR）多順反子的表達。 shRNAmiR轉錄物通過(gu家看ò)胞内micro-RNA途徑加工産生成讀媽(chéng)熟的shRNA，促進(jìn)靶基因mRNA的降解。

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與常規shRNA載體（利用RNA聚合酶III啓動子如U6介跳姐導shRNA的表達）不同，基于miRNA的shR下光NA幹擾載體系統采用了标準RNA聚合酶I做廠I啓動子，這(zhè)使得可以運用組織特異性，誘導型或可變強度頻銀的啓動子進(jìn)行實驗，而組成(chéng)型U6啓動子則無白員法實現。

RNA聚合酶II啓動子具有能(néng)夠有效轉錄長(c喝村háng)轉錄物的能(néng)力，相對(duì)于其他幹擾現現載體系統擁有許多額外的優勢。首先，多個shRNAmiR看子可以作爲單個多順反子進(jìn)行轉錄，在細胞内加工成(c藍用héng)成(chéng)熟的shRNA，這(zhè)使得單個轉村我錄物能(néng)同時(shí)票日幹擾多個基因或靶向(xiàng)相同基因内的多個區域。舊爸其次，在該載體系統中，用戶定制的蛋白編碼基因與shRNAmiR處于相同的多順反刀下子内，該ORF的表達可用于監測shRNA的轉錄（如果使用的是熒光/抗性标記）在員或可用于其他需要共表達ORF和shRNA的應用。

通過(guò)改造優化，我們的慢病毒載體删除了與文你病毒包裝和轉導相關的基因（這(zhè)些基因由輔助質粒進(jìn)行冷地表達，用于病毒包裝過(guò)程），使産生的慢病毒顆粒是複制缺又開陷型的。即包裝的病毒隻具有轉導靶細胞音身的能(néng)力，而無法在靶細胞中進(jìn)行大量複制，因而具有鐘書很高的生物安全性。

有關慢病毒載體的相關信息，請參考慢病毒基因表達載體。關于慢病毒miR30 中如;shRNA幹擾載體的更多信息，請參考以下文獻

參考文獻	主題
Cell Rep. 5:1704 (2013)	An Optimized microRNA Back好亮bone for Effective Single-Copy RNAi

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亮點

慢病毒miR30 shRN音匠A幹擾載體使用優化的micro-RNA系光用統，衍生自第三代慢病毒載體。經(jīng)優化，該載體在大腸杆菌體内具美章有很高的拷貝數，包裝的活病毒具有很高的滴度要錢，對(duì)大多數宿主細胞具有高效的轉導能聽訊(néng)力，能(néng)有效地把載體整合到靶細胞基因組并實現外源草近基因的高水平表達。用戶定制的啓動子可以驅動著服包含目的基因和一個或多個基于m這錢iR30的靶向(xiàng)目裡煙的基因的shRNA（shRNAmiR）的表達，音一從而介導有效的shRNA加工和靶基文窗因幹擾。

試驗驗證

圖1 miR30 shRNA慢病毒載體系統風冷的EGFP敲低和mCherry表達效果。（A）將(jiā視樂ng)含有CMV啓動子驅動的mCherry和打靶EGFP的miR30 shRN關文A的慢病毒載體包裝成(chéng)慢病毒顆粒。對(duì)照慢病毒載體具有相商資同的載體結構，但是使用了scramble 看哥shRNA。用這(zhè)些病毒轉導表達EGFP的HEK293T細胞。藥篩了近細胞後(hòu)，使用流式細胞術和熒光顯微鏡測定EGFP和mCherry的用章表達。(B) 熒光圖像和中值熒光強度 (現些圖中的 MFI ± SD) 表明，與scramble相比，靶向呢如(xiàng) EGFP 的 shRNA 顯著(zhe)降低了 EGFP 表行道達 (P<0.001)。此外，mCherry在任兒體一一種(zhǒng)經(jīng)過(guò)慢病毒轉導的細胞中均表達，但會厭在親本HEK293T-EGFP細很話胞中不表達。這(zhè)些結果表明，目的紙鐵基因和miR30 shRNA 都(dō這謝u)可以在pol II 啓動子的驅動這明下共表達。每組實驗重複三次，數據經(jīng)新間過(guò)雙尾t檢驗分析。

優勢

啓動子選擇多樣(yàng)：與利用RNA聚合酶III啓動子如U6的答了标準shRNA系統不同，基于miR30的shRN裡弟A可以通過(guò)多種(zhǒng)知老RNA聚合酶II啓動子轉錄，可以使用組織特異性或朋亮誘導型啓動子。

多個shRNA共表達：由于RNA聚合酶II能(néng)夠有效轉錄長(cháng)RNA，因此多個靜都shRNAmiR可以作爲多順反子由單個啓動子驅動表達。

可與報告基因ORF共表達：用戶選擇的目的基因或報告基因ORF與shRNAmiRs作爲多順反長工子一起(qǐ)共表達，有助于監測訊坐shRNA的轉錄。

永久性幹擾：慢病毒整合到宿主細胞基因組是一個不可逆的過(guò)程，對(duì)于靶基樂暗因的幹擾通常是穩定和永久的。基于這(z習為hè)個優勢，可對(duì)培養細胞或活體幹擾表型很個進(jìn)行長(cháng)期分析，有助于分離具有不同幹家厭擾水平和/或不同表型的克隆；當幹擾載體攜帶熒光标記如EGFP時(shí資愛)，可通過(guò)流式分選具有不同熒光強度（熒光強度和整合數量費空有關，進(jìn)而與幹擾程度有關）的細胞。

滴度高：我們的病毒載體可以包裝出高滴度的病毒。我們提供的病毒包裝服務，病冷話毒滴度可以達到>10⁹ TU/ml。在這(zhè)樣(yà得費ng)的病毒滴度下，如果選擇合适的劑量去轉導體外培東請養的哺乳動物細胞，則轉導效率可接近100%。

宿主範圍廣泛：我們的病毒包裝系統包裝出來的病毒含有VSV-G包膜蛋鐵年白，此蛋白擁有非常廣泛的親和性，可以轉導幾乎所有的哺乳動物細也習胞，包括分裂細胞，非分裂細胞，原代細胞，穩定算靜細胞系，幹細胞，分化細胞，貼壁細胞和站學懸浮細胞等各類哺乳動物細胞，甚至還(hái)可以轉導一些非哺乳動友街物細胞。使用傳統的轉染方式轉導神遠舞經(jīng)元細胞是非常難的，但是采用我們慢病毒載體系少器統可以輕易的實現神經(jīng)元細胞的轉導。相對(duì)于在某司地些細胞中具有較低轉導效率的腺病毒和不能(néng)用于非分裂細如得胞的逆轉錄病毒而言，利用我們的慢病毒包裝系統包裝可水出來的病毒具有廣泛的親和性。

基因拷貝數相對(duì)均一：通常情況下，采用病毒轉導的方式可以比較均一的人少將(jiāng)外源基因轉入靶細胞中，而傳統的質粒轉染則呈現出較高嗎員的不均一性，導緻某些細胞會(huì)獲得較多拷貝質粒而某些則會上說(huì)獲得較少甚至完全沒(mé知票i)有。

體内外實驗均有效：我們的載體不僅擁有良好(hǎo)的物物體外細胞轉導能(néng)力，同樣(yàng)适用于體内活體動物實司科驗。

安全性：我們的病毒載體系統具備了以下兩(liǎng)湖北大特點，因而具有非常高的安全性。一、病毒包裝和轉導所必需的城喝基因由三個輔助質粒分開(kāi)表達。二、5'船黃 LTR的啓動子自失活。因此，在進(jìn)線吃行病毒包裝和病毒轉導的時(shí)候不會(huì)産生具有複制能(nén跳很g)力的病毒顆粒，使用我們的載體對(duì)人體的健康威脅也是最低的。

不足之處

啓動子幹擾效應：啓動子強度、shRNA表達水平以及幹擾效果之間存在很大的相雪長關性。許多RNA聚合酶II啓動子比U6 RNA技弟聚合酶III強啓動子表達shRNA的能(n拿跳éng)力更弱，這(zhè)會(huì)導緻靶基因幹擾效果下降業電。

技術複雜：使用慢病毒載體時(shí)，需要在包裝細胞跳又中産生活病毒，然後(hòu)測定病毒滴度。因此慢病毒轉染相對(國草duì)于常規質粒轉染，技術難度更高從知，周期更長(cháng)

永久性幹擾：慢病毒整合到宿主細胞基因組是一個不可逆的過(guò)程，如果使用的物黃是組成(chéng)型啓動子，對(duì)于放木靶基因的幹擾通常是穩定和永久的。一旦慢病毒現說shRNA幹擾載體對(duì)基畫吃因産生了幹擾，目的基因的表達就(jiù)很難被(bèi)重新激活。根據不同的制有實驗目的，這(zhè)有可能(néng)是優勢頻拍也可能(néng)是劣勢。

載體關鍵元件

RSV promoter: Rous sarcoma virus pro但見moter. It drives transcriptio笑長n of viral RNA in p理讀ackaging cells. This RNA is the影技n packaged into live virus.

Δ5' LTR: A deleted version of the HIV-1路現 5' long terminal repeat. 厭多In wildtype lentivirus, 5' LTR 火玩and 3' LTR are essentially i市一dentical in sequence. They res街劇ide on two ends of the viral gen能生ome and point in the same dir林器ection. Upon viral inte鐘黃gration, the 3' LTR sequence i器要s copied onto the 5' LTR. The L內上TRs carry both promoter and p文愛olyadenylation fu你工nction, such that in報妹 wildtype virus, the 5' LTR acts as a 謝空promoter to drive the transcri友習ption of the vir朋明al genome, while the 3' LTR acts as a 醫新polyadenylation signal to termina雜日te the upstream transcript.他們 On our vector, Δ5' LTR is 都湖deleted for a region that is req做下uired for the LTR's promoter activit兵有y normally facilit美笑ated by the viral transcription fact南男or Tat. This does not affect the pro靜生duction of viral RNA during packagi火從ng because the promoter fu理爸nction is supplemented by the R畫書SV promoter engineer都行ed upstream of Δ5' LTR.

Ψ: HIV-1 packaging si為畫gnal required for 分土the packaging of vi上還ral RNA into virus銀錯.

RRE: HIV-1 Rev respons近機e element. It allows the nuclear expo票制rt of viral RNA by the viral Rev可藍 protein during 通很viral packaging跳低.

cPPT: HIV-1 Central polypurine tract. It cre綠場ates a "DNA fla樂工p" that increases nuclea中時r importation of th頻城e viral genome during target cell 事姐infection. This 數看improves vector integration into們車 the host genome, resulting in hi輛道gher transduction efficiency件見.

Promoter: Drives transcription道民 of the downstrea資些m ORF and shRNAmiR polyc兵土istron. This is an RNA poly電水merase II promoter, rather than an R在都NA polymerase III pro家放moter such as U6.

Kozak: Kozak consensus sequence. It is話見 placed in front of煙行 the start codon of 爸照the ORF of interest because窗友 it is believed to facilita廠議te translation initiat窗懂ion in eukaryotes.

ORF: The open reading frame友著 of your gene of 多些interest or repo街畫rter gene is placed here. This電都 can be used to monitor shRNA expressio西區n.

5' miR-30E: An optimized version of窗動 the human miR30 5’ context sequence. F身但acilitates maturation and processi離還ng of the shRNA and separation from錯場 the tandemly transcribed OR水放F and other shRN們書As.

3' miR-30E: An optimized version of the 是筆human miR30 3’ co綠通ntext sequence. Facilitat劇在es maturation and 通慢processing of the shRNA and s站老eparation from the tandemly transcribe但謝d ORF and other shRNAs.

shRNAs: These sequences are d綠站erived from your target 訊畫sequences, and are司紙 transcribed to form the stem port你得ion of the “hairpin” structure of th的間e shRNAs.

WPRE: Woodchuck hepatitis virus posttra頻又nscriptional regulatory ele厭拿ment. It enhances viral RNA st媽身ability in packaging ce呢黑lls, leading to higher titer of packa訊樹ged virus.

mPGK promoter: Mouse phosphoglycerate k坐外inase 1 promoter. This drives 吃短the ubiquitous exp友冷ression of the downstr件山eam marker gene.

Marker: A drug selection gene (su快北ch as neomycin res喝服istance), a visually detectable g影紙ene (such as EGFP), or a d房工ual-reporter gene (such技冷 as EGFP/Neo). Thi看議s allows cells transduced 美木with the vector to be selected 化事and/or visualized.

ΔU3/3' LTR: A truncated version of the HIV-1 3' lon生理g terminal repeat th不要at deletes the U3 region. This le舊站ads to the self-in錯自activation of the promoter ac靜看tivity of the 5' LTR 草房upon viral vector integration into煙腦 the host genome (due to t妹請he fact that 3' LTR is copied o慢場nto 5' LTR during 現河viral integration). The polyadenylati科數on signal containe房視d in ΔU3/3' LTR serves to te都腦rminates all upstream transcrip這湖ts produced both during viral 女舞packaging and after viral inte媽風gration into the host genome.

SV40 early pA: Simian virus 40 early polyadenyl得離ation signal. It further facili影慢tates transcriptional termination af也妹ter the 3' LTR during vir校藍al RNA transcription duri術物ng packaging. This ele計朋vates the level of functional viral玩花 RNA in packaging書又 cells, thus impr光短oving viral tite謝章r.

Ampicillin: Ampicillin resistanc北鐘e gene. It allo制見ws the plasmid 跳明to be maintained by ampic說著illin selection in E. coli年討.

pUC ori: pUC origin of replication. Plasmids 從員carrying this origin exist in high copy靜門 numbers in E. coli.

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