哺乳動物CRISPR（單gRNA）表達質粒載體

CRISPR/Cas9（規律成(chéng)簇的間隔短回文重複序列及相關蛋事可白9）核酸酶表達載體屬于幾種(zhǒng)新興的基因組編空農輯工具之一（另外兩(liǎng)種(zhǒng)是ZFN和TAL年為EN），可在基因組的靶位點快速街喝有效地産生突變。這(zhè)些質粒在拍載體編碼的特異性RNA，能(néng)夠引導DNA核酸酶（或缺刻酶）編輯基花道因組中特定位點的DNA序列。

Cas9是RNA引導DNA核酸酶，是天然原核免疫系統的一部分，賦予細菌産生對(物知duì)質粒和噬菌體等外源遺傳物質的抵抗能(néng)力。在細胞内，C房們as9核酸酶與引導RNA（gR我訊NA）形成(chéng)複合物，該複合物哥去通過(guò)與基因組中的18-22 nt的同源靶序列直聽技接相互作用，gRNA與靶位點通過(guò)互補配對(duì)使Cas9定位到劇時靶序列上，然後(hòu)切割基為放因組中的靶位點。爲了方便使用，我們設計的C歌草RISPR/Cas9載體能(néng)夠在一個載體上同時(shí)有效表達店農Cas9核酸酶（或缺刻酶）和引導RNA（gRNA）。

我們的CRISPR/Cas9表達載地熱體中有兩(liǎng)種(zhǒng)Cas9核酸酶供選擇，作銀一種(zhǒng)是标準的人源化Cas9（hCas9），能美對(néng)夠有效地在靶位點産生雙鏈斷裂（DSBs）；歌自另一種(zhǒng)是“缺刻酶”（Cas9_D10A），僅在線妹DNA中産生單鏈切割。如果將(jiāng)你快Cas9_D10A缺刻酶與靶向(x農頻iàng)兩(liǎng)條互補鏈的放路兩(liǎng)個gRNA一起(qǐ)使用，缺刻酶會(huì)在劇愛兩(liǎng)條鏈上産生單鏈切割，從而導緻靶位點處産生DSB。票員這(zhè)種(zhǒng)方法通常會(huì)減少CRISPR/Cas9脫不這靶效應，因爲它需要兩(liǎng)個g也通RNA同時(shí)靶向(xiàng)靶位點。

細胞通過(guò)非同源末端連接途徑日器（NHEJ）修複通常會(huì)産生小的片段或堿基缺失，插入和堿基要遠置換等突變。當這(zhè)些突變破裡自壞蛋白質編碼區（例如引起(qǐ)移碼缺失）時(shí)，會(h空海uì)引起(qǐ)功能(néng)性基因敲除。在少數情況男通下，CRISPR/Cas9載體和外源供體DNA模闆共同導入細胞時(做森shí)，細胞會(huì)通過(guò)同源性修複（HDR）機制來修複DSB照電，靶基因DNA序列會(huì)被(bèi)模闆序列取代，堿基發(fā)生改變少銀，如點突變等。缺刻基因組DNA也會(huì)經(jīng)常發(fā)生月和同源修複（HDR），如將(jiāng)外源模闆DNA與Ca兒草s9_D10A缺刻酶一起(qǐ)導入細胞中，有可能長我(néng)産生堿基改變。

利用CRISPR/Cas9系統可以有效靶向(校間xiàng)大部分DNA序列，而NGG（有時(shí)是NAG）是跳照必須的。NGG叫(jiào)做前間區序列鄰近基序（PAM），位于北間靶DNA，gRNA識别序列的3'末端。

關于該載體系統的更多信息，請參考以下文獻。

瞬時(shí)表達：轉染CRISPR/Cas9質粒載體後(hòu)，Cas雨農9蛋白和gRNA會(huì)在靶細胞中新不大量瞬時(shí)表達。如果沒(méi)有藥師技物篩選，質粒會(huì)随著(zhe)時(shí)熱公間流逝而丢失，在基因組編輯發(fā)間市生後(hòu)，靶細胞中的Cas9和gRN廠會A也會(huì)逐漸消失。

簡單易懂：gRNA和靶位點之間的簡單同源關系使得CRISPR/C事就as9系統簡單且易于設計。

具有脫靶效應：已有文獻報道(dào)CRISPR/Cas9坐電具有脫靶效應，通常TALEN系統比CRISPR城熱/Cas9具有更低的脫靶活性。通過(guò)將(jiān間機g)Cas9_D10A缺刻酶與兩(liǎng)種(zhǒn相內g)gRNA結合使用（如上所述），可以顯著減輕脫靶效應。

PAM要求：CRISPR/Cas9靶位點必術科須包含NGG序列（使用較多），也叫會西(jiào)做PAM序列，位于gRNA識别序列3'那訊末端。