哺乳動物增強子檢測piggyBac載體（體内）

概述

該載體系統設計用于在小鼠模型中，高效分析哺乳動物增章市強子。通常情況下，將(jiāng)感興趣的增強子克隆到該載體小月開鼠最小啓動子Hsp68的上遊，并將(jiāng)構建好(hǎ用答o)的載體用于制備轉基因小鼠。對(duì)拍樹轉基因胚胎或成(chéng)年小鼠中La水花cZ報告基因的表達情況進(jìn)行檢測，可以進(jìn)一步分析增強子的活師好性。

PiggyBac載體系統可以非常高效地票我把外源DNA插入哺乳動物細胞的基因組，該系統技術簡單高唱，可利用質粒轉染（非病毒轉導）把您所感興趣的基因長(cháng)期穩定麗到地整合到靶細胞基因組。

PiggyBac系統包含兩(liǎng)個載懂山體，一個載體被(bèi)稱爲輔助質粒，負責編碼轉座酶窗但；另一個載體被(bèi)稱爲轉座子質粒，包含兩(liǎng)個末端重複短高序列（TRs）以及兩(liǎng)者之間的被(bèi)轉座區域，需要被(b生腦èi)轉座到宿主基因組中的目的基因就(jiù)克隆在這(zhè)個區域。當國還輔助質粒和轉座子質粒共轉染靶細胞時(shí)門爸，輔助質粒産生的轉座酶將(jiāng)會(huì)識别筆地轉座子的兩(liǎng)個TR元件，然後(hòu)將(jiāng)被(b河件èi)轉座區和兩(liǎng)個TR元件插入到宿主基因組中。轉座器雪插入通常發(fā)生在包含TTAA序列的宿主染色體位點，并在亮化轉座子兩(liǎng)側出現TTAA重複序這河列。

PiggyBac屬于II類轉座子，通過(guò)“剪切—粘貼山這”的機制移動，從一個地方轉座到另一個地方，而不留下序列本身（恰好(hǎo)鐵請相反，I類轉座子是通過(guò)“複制—粘貼”的方式移動）。由于輔助質粒雨理是通過(guò)瞬時(shí)轉染進(jìn)入宿主細胞的，故會(hu南黃ì)逐漸丢失。随著(zhe)輔助質粒的丢失，轉座子在宿主男話基因組中變成(chéng)了永久整合。當這(zhè)些區對宿主細胞再次被(bèi)輔助質粒窗多轉染，整合的轉座子會(huì)再次通過(guò)“剪影很切—粘貼”的機制移動。

關于該載體系統的更多信息，請參考以下文獻。

參考文獻	主題
Nature. 444:499 (2006月姐)	Genome-wide testing of putative e南也nhancers in the mouse u舞就sing a related system
Development. 105:遠歌707 (1989)	Cloning of the Hsp68 minimal promoter信白
Mol Cell Biochem. 354:301 (2011)	Review of the piggyBac systems

亮點

我們的載體系統是基于piggyB鐵請ac轉座子系統而構建的。待測增費理強子位于小鼠Hsp68最小啓動子（Hs通水p68_mini）的上遊，可控制下遊高機LacZ報道(dào)基因的表達。有活性的增強子會(huì)促放南進(jìn)最小啓動子增強LacZ基因行廠的表達；在缺乏活性增強子的情況下書書，Hsp68_mini具有非常弱的本底表達歌醫能(néng)力，會(huì)使LacZ基因弱表達或不表達。在胚胎或組織切片中對紙，通過(guò)X-gal與LacZ的現路顯色作用可以高度靈敏地原位檢測增強子活性。

優勢

簡單且靈敏：使用LacZ作爲報告基因，X-gal染色會(現服huì)産生明顯的藍色，即使在低表達水平他吃下也可以輕松檢測到，因此可以非常靈敏地判斷增強子活性。

易于制備轉基因動物：通過(guò)常規原核注射，可以很錯民容易地高效制備轉基因胚胎或活體小鼠。

技術簡單：通過(guò)常規轉染即可把質粒轉入細胞，相比起(筆哥qǐ)病毒載體需要進(jìn)行病毒包裝，過(guò)程更簡單。

外源基因的永久整合：常規質粒轉染隻能(néng)實風數現外源基因的瞬時(shí)表達，這(zhè)種(zhǒng風拿)外源基因會(huì)随著(zhe)宿主細胞制北的分裂而不斷丢失，在快速分裂的細胞中顯得尤爲顯著。相反，暗照將(jiāng)PiggyBac轉座子載體和輔助質粒一起(qǐ)轉染是新到哺乳動物細胞中，由于轉座子在轉座酶的作用下，目的基因能(n書來éng)穩定地整合到宿主細胞的染色體中，從而實現轉座子載體上攜帶廠店的目的基因在宿主細胞中永久表達煙時。

載體容量大：我們的轉座子載體總容量可達30 kb，其中質下裡粒骨架隻占3 kb，有足夠大的容量可以放置客戶所感在身興趣的序列。

不足之處

需要輔助質粒：與常規質粒LacZ報告基因載體不同，piggyBac載體系統需要使用兩黑喝(liǎng)種(zhǒng)質粒，分别是輔助質粒討船和轉座子質粒。爲了有效地將(jiāng)增草商強子序列插入宿主基因組中，兩(liǎng)種(zhǒng)質粒必須存在于相同的子一細胞中。

載體關鍵元件

5' ITR: 5' inverted termi師有nal repeat. When a DNA sequence is業自 flanked by two ITRs, the piggy筆她Bac transposase can recogn現站ize them, and insert the f裡拍lanked region including the tw理物o ITRs into the host genome.

Enhancer: Your enhancer of interest is cloned h藍笑ere.

Hsp68: The minimal promoter sequence這關 from mouse Hsp68 (heat 我鄉shock protein 68 男分kDa). This will drive 畫外transcription of the reporter if 如河an enhancer element光票 is present to activate it. In the abs雜懂ence of such enhancer activity, the上城 minimal promoter only h拍大as basal activity.

LacZ: The beta-galactosidase reporter gene男行. The encoded enzyme converts th和路e colorless and soluble X-gal to an in低藍tensely blue ins我又oluble product that stains th姐文e cells in which LacZ is expresse書對d.

SV40 early pA: Simian virus 40 ear醫煙ly polyadenylation si她學gnal. It facilitates transcription間多al termination of the upstream ORF.

3' ITR: 3' inverted terminal r路議epeat.

Ampicillin: Ampicillin resistance gene. 林爸It allows the plasmid to be maintain個跳ed by ampicillin se少黃lection in E. coli.

pUC ori: pUC origin of repl議小ication. Plasmi可在ds carrying this origin exist in雪河 high copy numbers in E船熱. coli.

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