雲舟生物提供全方位的适用于體外和體内實驗的CRISPR基因編輯秒數解決方案。我們的 CRISPR 産品涵蓋多種(zh頻銀ǒng)預制或定制CRISPR載體白員（質粒、病毒和RNA）。我們的CRISPR系關線統可使用主流多種(zhǒng)工具病毒（慢病毒、金南AAV和腺病毒）進(jìn)行間雨包裝以實現在難轉染細胞中的高效基因遞送，此外謝和我們也專注于構建用于基因敲除、基音拿因激活、基因抑制以及CRISPR篩選門小的高質量CRISPR文庫。經(jīn議車g)過(guò)我們獨特設計的全基因組雙gRNA敲除文庫是用于人類和小鼠基因功費裡能(néng)篩選的強大工具。話熱
亮點
定制CRISPR載體
CRISPR介導的基因編輯需要靶細胞共表達C的又as9和特異性gRNA。使用我吃鐵們高度直觀的線上載體設計平台，您可以選擇超過(guò)3民美0種(zhǒng)載體骨架（非病毒的、病毒的或還不轉座子類型的載體）以及并可通過(guò)随意組合這線載體元件（啓動子、Cas9變體、熒光标記醫關和藥物篩選标記）來定制表達Cas9的gRNA。此外，我們還(hái)提供多費明合一和雙載體系統，可用常規質粒、慢病毒、AAV、腺病毒和P看器iggyBac載體表達Cas9和gRNA。 我們全面(m技店iàn)的CRISPR載體系列還(hái)包括以DNA模闆形式存在的基因打靶刀暗供體載體，以滿足精确指示序列變化的基因編輯需求，比如通過(guò)H些購DR在目标位點進(jìn)行點突變和大片段敲入。此外，我樹你們還(hái)提供CRISPRa和CRISPRi載體，分别用于實現靶基因紙數的轉錄激活或抑制。我們提供的CRISPR基因表達調控載體包括基于dCa影生s9-SAM或dCas9-SunTag學人機制的CRISPR激活和基于dCas9-KRAB或dCas9-KRAB-M光生eCP2機制的CRISPR抑制等應用類型。
將(jiāng)CRISPR載體添加到您的購物車時(shí)，您還(飛睡hái)可以在其下遊服務購買質粒花錯DNA制備、RNA制備和病毒包裝。
注意：AAV基因組的裝載量爲4.7kb。來自St區裡reptococcus pyogenes的常用SpCas9基嗎藍因長(cháng)度爲4.2kb，當其與啓動子、polyA些懂信号序列以及gRNA表達盒等其他組件組合時(shí)，整個序列幾乎喝上無法裝入AAV病毒。因此，我們的标頻月準AAV CRISPR系統使用來自金黃色葡萄球菌（Staphyl一少ococcus aureus）的較短的SaCas9（資可3.2kb）。請注意，SaCas9識别的PAM序列是NNGRR或NNGRR那線T（首選），而SpCas9的PAM信頻序列是NGG。我們還(hái)可以著科根據要求構建AAV SpCas9載體。
預制CRISPR載體
除了定制的CRISPR/Cas9載體，我們還(h綠國ái)提供預制的Cas9表達載體、gRNA載體以及适用于CRI裡都SPRa和CRISPRi的輔助載體。我們的載體默認以甘油菌形式發答金(fā)貨。您也可以在載體設計日紅的下遊服務進(jìn)一步訂購質粒DNA制備、RNA制備以及病毒包裝等服務吧子。
| 載體系統 | 載體名稱 | Vector ID |
|---|---|---|
| hCas9表達載體（質粒載體） | pRP[Exp]- mCherry/Hygro-CBh>hCas9 | VB010000-9378bvk |
| hCas9表達載體（慢病毒） | pLV[Exp]- CBh>hCas9:T2A:H舞銀ygro | VB010000-9380sne |
| SaCas9表達載體（AAV） | pAAV[Exp]-CMV>SaCas9 | VB010000-9382per |
| hCas9表達載體（腺病毒） | pAV[Exp]-CBh>hCas9 | VB010000-9381pwj |
| hCas9表達載體（piggyBac） | pPB[Exp]-mCherry/Hy到做gro-CBh>hCas9 | VB010000-9379gqq |
| Scramble gRNA對(duì)照載體（質粒載體） | pRP[gRNA]-EGFP/Puro-U6>路一Scramble_gRNA | VB010000-9358ttk |
| Scramble gRNA對(duì)照載日媽體（慢病毒） | pLV[gRNA]-EGFP/Puro-U6>Scrambl拍謝e_gRNA | VB010000-9359hhe |
| Scramble SagRNA對(duì)照載體（森冷AAV） | pAAV[SagRNA]-EGFP-U6>Scra你小mble_SagRNA1 | VB010000-9361zjr |
| Scramble gRNA對(duì)照載弟如體（腺病毒） | pAV[gRNA]-EGFP-U6>Scramble_gRNA1 | VB010000-9360nph |
| Scramble gRNA對(duì)照載體（piggyBac） | pPB[gRNA]-EGFP/Puro-U6&月要gt;Scramble_gRNA1 | VB010000-9362zuk |
| hCas9與scramble gRNA共表達載體（質粒載體）算又 | pRP[CRISPR]-EGFP/Puro-hC弟議as9-U6>Scramble_gRNA1 | VB010000-9354ztt |
| hCas9與scramble gRNA共表達載體（慢病毒） | pLV[CRISPR]-hCas9/Pur兵銀o-U6>Scramble_gRNA1 | VB010000-9355sqw |
| SaCas9與scramble SagRNA 共表達載體（AAV） | pAAV[CRISPR]-SaCas9-U6數說>Scramble_SagRNA | VB010000-9357zmm |
| hCas9與scramble gRNA共表達鐘懂載體（腺病毒） | pAV[CRISPR]-hCas9/EGFP-U6就腦>Scramble_gRN近商A1 | VB010000-9356pn拍少a |
| dCas9-SAM激活系統的MS2腦外/P65/HSF1表達載體（慢病毒） | pLV[Exp]-EF1A>MS2/P6嗎為5/HSF1/Hygro | VB010000-9383ff但通r |
| dCas9-SAM激活系統的dCas9/VP64表達技計載體（慢病毒） | pLV[Exp]-EF1A>dCas9/VP64/Bsd | VB010000-9384wwc |
| dCas9-SAM scramble msg看冷RNA對(duì)照載體（慢病毒） | pLV[msgRNA]-EGFP/Puro-U6>Scramble_g不務RNA | VB010000-9363gsm |
| dCas9-KRAB-MeCP2表達載體（舞道慢病毒） | pLV[Exp]-CBh>dCas9/ KRAB/MeCP2:T2A:H見火ygro | VB010000-9386mwf匠日 |
CRISPR病毒包裝
慢病毒、AAV 和腺病毒被(b一對èi)廣泛用于將(jiāng)CRISPR煙能組分遞送至哺乳動物細胞中。雲舟森草生物提供優質的慢病毒、AAV 和腺病毒包裝服務，來劇幫助您在難轉染細胞中實現高效的CRI國下SPR基因編輯。我們的病毒包裝使用我們專有的技術和自我研發(路他fā)的試劑，大大改進(jìn)了産毒的滴度、純度機廠、活性和一緻性。我們的包裝方案還(hái)會(huì)針對(duì)我們的載體金醫構建服務中使用的病毒載體系統進(jìn)行優化。
CRISPR（3+1）套裝
如果您需要同時(shí)訂購多個CRISPR慢病毒，我們推薦間分您訂購我們的CRISPR（3+1）套裝。如果您僅需要訂購3個用于CRISPR他懂實驗的gRNA慢病毒載體，我們亦提供CRIS討門PR載體構建3件裝：
| 服務名稱 | 價格（CNY） | 周期 | |
| CRISPR慢病毒載體（3件裝）構建 | ￥1,980 | 4-7天 | 訂購咨詢 |
| CRISPRi慢病毒載體（3件南黃裝）構建 | ￥1,980 |
gRNA和Cas9 mRNA
雲舟生物可提供用于轉染和微量注射的Cas9日又 mRNA和gRNA，這(zhè)些Cas9 mR那就NA和gRNA專門爲靶向(xiàng)用戶選擇的目标位點而設計，并且有雪公助于 RNA 組分成(chén的木g)功遞送至哺乳動物細胞中。我們的Cas9 mRNA可用于表達站關野生型 hCas9或 Cas9 切口酶（Cas9(D10A)）。高讀我們的gRNA設計和評分使用了CRISPR文庫設計（CLD）中遠個的規則，并應用一組經(jīng)驗規則來設計針窗裡對(duì)用戶選擇的基因/位點的最佳電通gRNA。
| 名稱 | 規格 | 價格（CNY） | 周期 | |
|---|---|---|---|---|
| hCas9 mRNA | >500 ng/ul，25 ul，無酶水，無菌 | ￥2,980.00 | 2-4天 | 訂購咨詢 |
| Cas9(D10A) mRNA | ||||
| 定制的gRNA* | ￥2,580.00 |
用于精确基因編輯的供體DNA
雲舟生物提供線性化質粒形式的ssODN或dsDNA的供體DNA舞視模闆，用于指導基于HDR機制的DNA修複，從而在CRISPR切割東空位點精确地進(jìn)行DNA序列編輯，這(zhè)老從通常包括點突變以及小片段或大片段敲入。ssODN可用于美我在目标位點插入短的DNA序列（<60bp），比如小标簽視呢或限制性酶切位點，而dsDNA供體則可用于靶向(xiàng放遠)敲入較大的序列（長(cháng)達4-5kb），例如舞玩熒光标簽和其他報告基因。
| 名稱 | 價格 | 周期 | |
|---|---|---|---|
| ssODN（通常爲120-200 nt） | ￥2399.00起(qǐ) | 2-3周 | 訂購咨詢 |
CRISPR文庫
雲舟生物專門爲常用的CRISPR應用定制并構建各種(zhǒng)文庫，包括用聽舊于基因功能(néng)篩選的敲除文現玩庫、用于基因獲得性功能(néng公費)篩選或非編碼區域調節功能(néng)篩選的CRISPRa文庫，以及票討用于基因功能(néng)喪失篩選或非編碼區域調節功能(néng學行)篩選的CRISPRi文庫。此外，我們還(h務路ái)可以構建用于單細胞篩選的CRISPR barcode文庫，以及利用不答其它CRISPR技術構建的文庫司吃
我們可以根據您的需求，將(jiāng)您的低算文庫以甘油菌、質粒DNA或病毒形式提供。我們的定制文庫均經(jīng)來站過(guò)NGS測序驗證。
除了定制的CRISPR文庫外，我們還(hái)化少提供預制的雙gRNA慢病毒文庫，用于人類和小鼠的林資全基因組基因敲除篩選。對(duì)于基因敲除篩選，雙gRNA文庫請內比單gRNA文庫更強大，因爲通過(guò)機高一對(duì)針對(duì)同一基因的g弟機RNA引入大片段缺失所在産生功能(n遠服éng)喪失突變比使用單個gRNA具有更高的效率。人和小鼠雙gRNA文庫以為船預制的高滴度慢病毒的形式制成(chéng)，分别靶向(xiàng)20,048話讀個人的和20,493個小鼠基因。每個基因都(d廠我ōu)被(bèi)不同載體上的4-6對河短(duì)不同的gRNA冗餘地靶向(x會說iàng)。
CRISPR系統解決方案
CRISPR系統的多功能(néng)性使其适用于哺乳動物細胞中的各類基因雪她編輯應用。我們的技術團隊在分子生物學(xué)應用方面(miàn)擁有豐富的校了經(jīng)驗，可以爲您的所有CRISPR基因編輯項目提供完整的技術方見亮案。我們可以幫助您處理下面(mi雨車àn)列出的常見CRISPR應用，或與您合作開(kāi)發(fā)任何新的船電CRISPR應用。立即向(xiàng)我們發(fā)機又送設計請求，以獲得免費的服務方案。
CRISPR基因編輯原理
常規使用的CRISPR系統由兩(liǎng)個音中組分構成(chéng)：Cas9蛋白和向(x玩東iàng)導RNA（Guide RNA，gR微分NA）。最常用的Cas9是從Streptococcus pyogenes細菌中化坐通過(guò)基因工程獲得的（又名SpC拿你as9或hCas9）。它是一種(zhǒng) RNA 引導他音的 DNA 核酸酶，可以在靶位點産生DNA雙鏈斷裂 (Doubl煙街e strands DNA break，DSB)（圖1）。另一種(zhǒng)廣泛使用的Cas9變體，即具有“切麗來口酶”性質的Cas9，比如Cas9(D10A)，可對(duì)DN大兒A單鏈進(jìn)行切割。如果將(jiāng)Cas9切口酶車兵與兩(liǎng)個gRNA同時(shí)使用，并且兩(liǎn制子g)個gRNA分别靶向(xiàng)位于單報微個目标區域兩(liǎng)側的兩(liǎng)條相反DNA鏈，則切口和內酶將(jiāng)在每條鏈上産生一個單鏈切得件口，從而導緻目标區域發(fā)生DSB。一旦通過爸文(guò)CRISPR系統産生DSB，細胞就(jiù)會(huì)激活非理那同源末端連接 (Non-homologous End Joining-NHEJ服哥，NHEJ) 途徑來修複DNA斷裂，這(zhè)通常會(huì)導緻少如農量堿基的随機缺失，或者發(fā)生更罕見的堿基插入和堿基替換等突變。當這(女花zhè)些突變破壞了蛋白質編碼區的序列時(shí)（例如發(f又森ā)生移碼突變），則可能(néng)引發(fā)功行資能(néng)性的基因敲除。
圖1 CRISPR引發(fā)的DNA修複機內下制
另一種(zhǒng)情況是，當共視兵同引入外源的供體DNA模闆和CRISPR組件時(shí)，細胞可身坐以通過(guò)同源重組修複 (Homology dir相離ected repair，HDR) 途徑修複D大樹SB。這(zhè)種(zhǒng)修複方式效率近也較低，并導緻目标基因組DNA序列被(b地就èi)供體序列替換，該機制有利于精确地改變DNA序列，例如水門産生點突變或在目标位點敲入供體DNA序列。供體DNA模闆友舊可以是單鏈寡核苷酸（ssODN）短花或dsDNA 片段（通常是線性化的質粒DNA）。ssODN适用劇機于引入點突變或小标簽插入，而ds生視DNA片段則更适用于大片段敲入。
圖2 RNP法驗證基因敲除效率。通過(guò)兒也gRNA-Cas9核糖核蛋白（女什RNP）方法獲得純合敲除突變。（A）編輯過業說(guò)的RNP複合物通過(guò)長有電轉法導入靶細胞，分離單克隆細胞并篩選。使用PCR和Sa地理nger測序驗證細胞的基因型。（B）本案例在小鼠結路答腸癌細胞中進(jìn)行基因編輯。RNP通過(guò)電轉進(jìn)入細員拿胞後(hòu)，可以結合靶基因的兩(liǎ水可ng)個位點以敲除一段長(cháng)13 kbp的區域鐵但。P1-P4四條引物用于三個PCR反應以區分敲除和野生型克得土隆。（C）PCR結果驗證了克隆1中的純合敲除突變，并進(吧女jìn)一步在（D）靶基因測序結果中得到印證。
催化活性失活的Cas9（dCas9）可以與不同和空形式的轉錄複合物結合以實現CRIS場土PR介導的内源性基因轉錄調控。對(duì)于轉錄激歌票活，通常可使用協同激活介導系統河些（Synergistic Activation Mediator，照外SAM）。該系統使用了三種(zhǒng)組件：dCas9農女/VP64融合蛋白、MS2/P65/HSF1輔助蛋白、以及一個修飾的朋鄉gRNA。dCas9蛋白經(jīng)過(guò)改造美男結合了VP64，一種(zhǒng)協同能間轉錄激活因子，而經(jīng)過(guò)紙匠修飾的gRNA則含有一個MS2适配金兒體，可以招募MS2複合物。MS2複合物下技包含轉錄激活結構域NF-kB (p65)和HSF1。VP64包含四個來源于單風車純疱疹病毒蛋白16的重複序列，其C端融合至Cas9蛋白使其可以招募轉錄員女激活相關的蛋白來激活基因表達。p65和HSF1的轉錄激活結構域還(hái)快服可以作爲潛在的轉錄激活因子招募與啓也秒動子或增強子結合的輔因子。總而言之，dCas9/VP64和M海在S2/P65/HSF1複合物可以協同工作的方式以激活靶基見文因表達，如圖3所示。除了SAM系統，雲舟生物還(hái銀唱)可以提供dCas9-VP64-p65-Rta（VPR來厭）轉錄激活結構域，使用EB病毒R順式激活因子替換HSF1轉錄激活結工從構域。
相對(duì)的，如果需要抑制靶基因表達，dCa理短s9也可以被(bèi)改造爲含有一個轉錄抑制結構域，如KR冷街AB（krüppel-associated 兵視box）結構域和MeCP2。我們可提供兩(liǎng)種(zhǒn可窗g)dCas9/KRAB輔助載體：原版的以及改造優化後(hòu)長水的兩(liǎng)個版本。該改造版本舊體將(jiāng)dCas9同時(shí)融合了兩(liǎn路報g)個轉錄抑制結構域KRAB/MeCP2，以便提供針對(d話生uì)靶位點效果更強的轉錄抑制。當gRNA招募dCa放懂s9/KRAB/MeCP2到内源性啓動子，如圖3所示，轉錄被(bèi)抑制。KRAB結構域常在人的轉錄因子中被(bèi)找到化有，是人類基因組中所發(fā)現的最常見的強效轉錄抑制因子之一。M化河eCP2可以通過(guò)招募組蛋白脫乙酰基酶，造成(ch家子éng)染色質凝聚和表觀遺傳抑制，進(去子jìn)一步增強KRAB介導的轉錄抑制效果。CRISPR基因調控但很可以被(bèi)用于大量的應用場景，比如通錢測試染色質上的調控元件、調控目的基因的表達、以及全基因組篩選等。
圖3 基于慢病毒的CRISPRa系統的基因上調秒朋表達效果。（A）SAM複合物示意圖。首什友先向(xiàng)NIH3T3細胞共轉導兩(liǎng)種(zhǒn電能g)分别攜帶dCas9:VP64和光服MS2:P65:HSF1的慢病毒海人，進(jìn)行抗性篩選。然後(明我hòu)使用遞送msgRNA的第三種(zhǒng)慢病毒轉導細胞，并用另一種(水海zhǒng)抗生素進(jìn)行篩選。（B）針對(du科音ì)靶向(xiàng)mBrn2基因啓美通動子區域而設計的msgRNA。（C） 通過(guò)qRT-P北醫CR測量mBrn2的相對(duì)基因上北表達，量化了使用Scramble、msgRN購請A以及空白對(duì)照（NC）轉導的并經大他(jīng)過(guò)抗性篩選的NIH3T3細胞中mBrn唱畫2轉錄産物表達量。Mean±但日;SD，*P<0.05，Turkey事(shì)後(h北場òu)檢驗。
圖4 基于慢病毒的CRISPRi基因抑制表達效果。（A）轉錄制農阻遏複合物示意圖。首先向(xiàng)Jurkat細胞轉如不導攜帶dCas9:KRAB:MeCP2的慢病毒以表達轉錄阻遏複合物，然後(睡中hòu)進(jìn)行抗性篩選。然後(hòu)用另一種(zhǒng)慢病多音毒轉導細胞以表達scramble或者gRNA，并進(jìn)行額外的抗性篩樹窗選。（B） 靶向(xiàng)CXCR4基因啓動房和子區的gRNA。（C） 通過(guò)qRT-PCR測量CXCR4的相對(du吧公ì)基因表達，量化了使用Scramble、gRNA以及空白城生對(duì)照（NC）轉導的病經(jīng)過(紙土guò)抗性篩選的Jurkat細胞中CXCR4轉錄産物表達量。M花媽ean±SD，***P<0.001，水信****P<0.0001，Tukey事如煙(shì)後(hòu)檢驗。（D） 通過(guò)western blot證去大實了含有打靶gRNA的Jurkat細胞中的CXCR4表達水平下調。（E美車）向(xiàng)細胞表面(miàn)表達有CXCR4蛋白的Jurkat農公細胞轉導scramble以及打靶CXCR4的gRNA，使用流式細胞術驗飛弟證。CXCR4使用單克隆一抗（Ab）标記，并連接帶有熒光基團的二抗。陰性對(d中高uì)照中的Jurkat細胞隻使用了無标筆明記的二抗。（F）轉導了打靶CXCR4的gRNA的Jurkat細胞相較于轉導議雨了scramble gRNA的平均信市減少了50%細胞表面(miàn)的CXCR4含量。Mean&pl些空usmn;SD。
CRISPR基因遞送方法
CRISPR組件可以通過(guò)不同的方式引入哺乳動場快物細胞内（圖5）：
圖5 遞送CRISPR組分至細胞内的方法
下表展示的是每種(zhǒng)遞送方式的日黑優勢與不足，有助于爲您選擇合适的CRISPR遞送系統提供參考：
| 遞送方法 | 優勢 | 不足 |
|---|---|---|
| gRNA與Cas9質粒 |
|
|
| gRNA與Cas9病毒 |
|
|
| 混合的gRNA和Cas9 mRNA |
|
|
| 有功能(néng)的gRNA-Cas9 RNP複合都得物 |
|
|
gRNA數據庫
雲舟生物的線上CRISPR載體設計工具可提供學村針對(duì)人類、小鼠以及大鼠全風船基因組的gRNA數據庫，旨在幫助您快速設計具有高打靶效率的CRISPR少這載體。我們的gRNA設計和評分使用了CRISPR文庫設計（姐唱CLD）中的規則，即對(duì)于一個打靶某個物種(zhǒng)中的玩我N(20)NGG序列的給定的gRNA，我們搜索該物種(z店小hǒng)基因組中的所有潛在脫靶位點，且月化與目标序列比對(duì)≤3個錯配堿謝又基。以這(zhè)種(zhǒng小資)方式識别的每個潛在脫靶位點，都(醫服dōu)會(huì)計算一個脫靶分值。 然後(hòu)將(jiāng)會黃所有脫靶位點的分值彙總用于計算gRNA的最終特異性分值，該數值介于0到一些100之間，值越高表示靶向(xiàng)特異性越強。請注意，特異司志性分值隻是一個粗略的指導。實際的打靶效率和特異性可能(néng)與預測值不同離問。得分低的gRNA可能(néng)仍亮城然有效。
當您在我們的線上平台上設計CRISPR載體時(shí西好)，您可以在我們的數據庫中搜索您的目标基因。 輸入基因名稱後(h文路òu)，您將(jiāng)在我們的數據庫中看到針對(duì)您的木術目标基因的所有可用的gRNA的詳細信息白飛。 我們的全基因組 gRNA 數快大據庫可讓您輕松地爲您的目标基因挑選合适的向(xiàng)導序列，同我為時(shí)無需自行查找和分析打靶位點，對(duì)比常見的gRN草我A設計工具有著(zhe)無可比拟的優勢。
此外我們的在線“學(xué)習中心”這放包含豐富的學(xué)習資源，可幫助您安排并實施您的CR訊通ISPR實驗。
暫無
爲了确定哪種(zhǒng)方法最适合您的到微實驗應用，以下是您應該考慮的一些事(shì)項。
基因敲低載體
基因敲低載體表達shRNA抑制弟服靶基因的mRNA，通過(guò)引發(fā)mRNA的切割抑制翻譯過(guò)工木程。shRNA敲低不改變靶基因的D機的NA序列。
基因敲除載體
CRISPR和TALEN都(dōu)是通過(g姐鐘uò)指導核酸酶切割基因組中的特定靶位點來發(fā)揮作用。然後(hòu)用生這(zhè)些切割位點被(bèi)細胞低效地修複，從而導緻修複部位的永花那久性突變，比如産生基因的小片段插入或堿基缺失。這(zhè)類突變的一部分會(紙拿huì)導緻基因的閱讀框移碼、出現提前動從終止密碼子等，最終導緻目的基因的功能(nén紅物g)喪失。如果同時(shí)靶向(xiàng)基因組中兩(li女銀ǎng)個相鄰緊密的切割位點（距離幾個kb），也可以導緻其間區域的删除謝我。
shRNA敲低永遠不會(huì)完全抑制靶基因的表達。即對的使對(duì)于最有效的shRNA，靶基因的一些殘留表達也小來會(huì)保留。相比之下，在一小部分經(jīng)過(guò)處理都我的細胞群中，CRISPR和TALEN可以路船産生永久性突變，這(zhè)可能(néng)導緻基因笑厭功能(néng)完全喪失。
shRNA載體通常在轉染/轉導的細胞時(shí)獲得較好(hǎo)坐村的均一性，實驗之間的一緻性也較佳。相比之下，由于引入突變是随機的，CR廠請ISPR和TALEN的基因編輯效果在細胞之間的差異相當大。爲了謝術完全敲除細胞中的目的基因，必須敲除細胞中基因的所有章美拷貝。鑒于正常細胞具有任何基因的兩(liǎng)個拷個間貝（X或Y連鎖基因除外），而癌細胞可以具有兩(li畫文ǎng)個以上的拷貝，這(zhè)種(zhǒng)完全敲除的細胞可能(né可身ng)隻占所有處理後(hòu)的細胞的一小部分。出于這(zhè)個原因，到熱核酸酶介導的敲除實驗需要通過(技知guò)測序來篩選克隆，以确定所有目的她新基因拷貝都(dōu)被(bèi)敲除的子細筆們胞群。
已有報道(dào)表明shRNA介導的基工兒因敲低和核酸酶介導的基因敲除均會(huì)産生脫靶效應。脫靶日現效應的表征可以通過(guò)使用多個不同的shR東新NA 靶向(xiàng)同一基因來評估。如果一個基因被(bèi)司公在多個不同的shRNA作用下仍然表現出一緻的表征，則低們這(zhè)種(zhǒng)表征通常則不是脫靶效應帶來的。對(duì城玩)于CRISPR或TALEN基因敲除，應分析含有功能(néng)近得喪失突變的多個克隆，以包含可能(n木多éng)由脫靶突變引起(qǐ)的任何表征。身南此外，可以對(duì)克隆進(jìn)行脫靶位點測序，通過(guò)生物信訊煙息學(xué)方法鑒定以查看它們是自他否已發(fā)生突變。
CRISPR系統和TALEN系統均能(néng)用于在體外細胞和模機大式生物這(zhè)種(zhǒng)進(jìn)行基因編輯。以討個下是這(zhè)兩(liǎng)種(zhǒng)系水黃統的特性對(duì)比：
CRISPR
CRISPR系統使用位點特異的向(通愛xiàng)導RNA (gRNA) 將(jiā鐘很ng)Cas9核酸酶引導至其基因組中的目标位點以産生D黃子NA切割。靶序列的長(cháng)度通常約爲20 bp。若她你靶序列中包含一些錯配位點仍可能(nén熱地g)被(bèi)識别和切割。
TALEN
TALEN系統使用的是一對(duì)嵌合蛋白件刀，每個嵌合蛋白包含一個融合到Fokl核酸酶結構域工業的且作爲TAL效應子的DNA結合結構域（識别特定公些DNA序列）。這(zhè)對(du海兒ì)蛋白被(bèi)設計成(chéng)與基因組些高中的一對(duì)靶位點結合，每個靶位點長(cháng)約18時事 bp，且二者相隔一個14-20 bp的間隔區。在與 DNA 結合後(hò司朋u)，這(zhè)對(duì)蛋白上的Fokl核酸酶結構域發(你鐵fā)生二聚化，然後(hòu)導緻兩(liǎng)個靶位點之間的音上間隔區内的序列發(fā)生切割。
CRISPR和TALEN系統均在基因編輯上均表現出良好(hǎo)的效率，這但們(zhè)也具體取決于應用的物大美種(zhǒng)和細胞類型。一般來說(shuō)，CRISPR系統的組分紅話進(jìn)入細胞後(hòu)引發(fā)的DNA切割懂兵比TALEM系統更高效。
CRISPR系統的gRNA靶向(xiàng)約20場笑 bp的DNA序列，而TALEN系統需影間要約36 bp的靶序列。此外，Cas9/gRNA 複合物知美對(duì)靶序列中堿基錯配（北是最多5 bp錯配）的容忍度高于 TALEN。因此，TALEN小可介導的DNA切割比CRISPR具有更好(hǎo)的特異性，也不太街還可能(néng)在基因組中發(fā)生脫靶性的切割。相比之下，已有報道(dà是討o)表明CRISPR系統在體外細胞系中務歌可産生脫靶效應，而對(duì)CRISPR敲除小鼠的分街唱析則表明體内實驗時(shí)脫靶頻率較低。最新的CRISPR系統的顯著(zh匠懂e)增強了CRISPR的特異性視校。通過(guò)使用雙gRNA和Ca知術s9切口酶（僅包含一個具有催化活性的核酸酶結構域的Ca窗外s9突變體，如Cas9(D10A)和Cas9_H840A），在靶向(大短xiàng)區域附近産生兩(liǎng)個單鏈D明長NA切口，從而導緻DSB發(fā)生在可修複的靶向(xià答金ng)區域内。在這(zhè)種(z坐短hǒng)設計中由于雙gRNA可將志但(jiāng)靶向(xiàng)序列的長下花(cháng)度擴展至約40 bp，因此最大限度地話年減少了脫靶效應。
TALEN系統可以針對(duì)基因組中的幾乎任間白何位置進(jìn)行設計。相比之下，CRISPR系統中的靶位要南點選擇受限于PAM序列（通常爲NGG土校）的要求，該序列位于gRNA靶向(xiàng)的DNA序列的3'末南訊端。CRISPR系統的這(zhè)種(zhǒng)特年房性這(zhè)并不會(huì)阻礙基因敲除，因爲對(duì)靶基因湖船中的任何地方切割都(dōu)是有效的基因編輯，但可能(néng)難討飛以對(duì)基因的特定位置進(jìn)行切割或實現位點的特異自船性突變。爲了通過(guò)將(jiāng)C跳到RISPR系統應用于可精确編輯特定基因組位點，可以將(jiāng)包含看雨所需編輯序列的同源重組供體載體或長(ch分志áng)寡核苷酸與靶位點的上遊和下遊同源臂一拍黃同遞送至細胞中，以指導靶位點發(fā)生HDR介導的DN票人A修複。
在基因編輯實驗中，使用CRISPR系統在幾個方面(miàn)表現出對(用可duì)比TALEN具有更低的技術難道(dào)。 首先，對(duì)于載農公體構建，CRISPR 系統隻需要合成(chéng吧技)一個短的gRNA，因爲Cas9/gRNA 複合物的靶向(xiàng花請)依賴于機制簡單的RNA/DNA雜交，而TALEN 系統需要根據每個河街獨特的蛋白-DNA相互作用重新設司東計TAL的DNA結合域。與TALEN系統相比，gRNA顯然說姐是更便宜、更容易設計和構建的，而且明家TALEN系統打靶每個位點總是需要醫自兩(liǎng)個載體。其次，對(d相通uì)于一些應用，例如注射小鼠胚胎，Cas9蛋白和gRN睡服A可以通過(guò)直接注射來高效地遞送，但TALEN系統不能(néng)。最讀但後(hòu)，CRISPR系統在基因篩選實驗錢多中的應用非常廣泛，表達數千種(zh錢舊ǒng)不同gRNA的CRISPR篩選文庫可以很容拍員易地以高通量方式構建。
對(duì)于CRISPR介導的基因編輯，Cas9核酸酶兒新通過(guò)特異性的gRNA作用至靶畫快位點以産生DNA切割。在大多數情況下，爲了實現簡單的基因敲除，可以將(jiā光水ng)單個gRNA與Cas9共同使用以産生DSB，然後(hòu)通過通個(guò)NHEJ進(jìn)行低效率的DNA修複問商，從而導緻序列發(fā)生永久性突變，比如産生基因的小片段插高道入或堿基缺失。這(zhè)類突變的一部分會(huì)導緻基因的閱讀河地框移碼、出現提前終止密碼子等，內道最終導緻目的基因的功能(nén機著g)喪失。
雙gRNA則一般用于結合Cas9(D10A)切口酶對(來討duì)靶位點的兩(liǎng)黑要條反向(xiàng)DNA鏈進(jìn)行切割。在這(zhè)種(zhǒng)那科方法中，切口酶將(jiāng)在兩(liǎng)條鏈上産生單鏈切割，每一體一條鏈上的切割位點通過(guò)兩(liǎng)件明條gRNA中的一條引導，然後(hòu)在靶位點厭動産生DSB。一般來說(shuō小黃)，這(zhè)種(zhǒng)方法減少潛在的脫靶效應，因爲該種(zhǒng)黑放DSB的産生要求兩(liǎng)條gRNA同河我時(shí)靶向(xiàng)序列。
當使用Cas9(D10A)切口酶和外源供體 D跳雪NA 模闆將(jiāng)特定林事的堿基（例如敲入）引入感興趣的基因時(sh紅年í)，也可以使用雙gRNA。在這(zhè著文)種(zhǒng)方法中，兩(liǎng)條刀自反向(xiàng)的DNA鏈將(jiāng)被(bèi)兩(liǎng)個gR還女NA靶向(xiàng)位于所需突變位點兩(li現們ǎng)側的兩(liǎng)個位點，河雪然後(hòu)通過(guò)HDR途徑利用外源DNA供體模闆來動的修複切除的序列。
服務商工作站 >>
