哺乳動物基因FLEX條件性表達載體（Cr木坐e-On）

概述

在哺乳動物細胞和動物中，該常規質粒FLEX（Flip-Excision）條答工件性基因表達載體系統Cre-on，通過(gu事睡ò)Cre重組酶條件性激活目的基因的表達。FLEX Cre-on系統利用位于麗離目的基因兩(liǎng)側的Lox-多光變體重組位點，在Cre重組酶的調控下目的基因發(fā)書道生反轉，目的基因正常表達；而Cre不存在的情況下，目的基因不制訊表達。

FLEX Cre-on系統由兩(liǎng)對(duì)異型Lox-變體重那的組位點組成(chéng)，其中野生型序列稱爲LoxP，突變體稱爲Lox師算2272，分别位于反向(xià議拿ng)基因ORF（相對(duì)啓動子方向(xiàng)而言）的兩(li家化ǎng)側。兩(liǎng)種(zhǒng)Lox-變體都(dō麗在u)可被(bèi)Cre識别，但隻有相同的Lox位點對物在(duì)可以彼此重組，與其他Lox-變體不能(néng)進(jìn)行現件重組。 LoxP和Lox2272位點以自飛交替方式位于ORF兩(liǎng)端，務聽每對(duì)位點互爲反向(xiàng)。Cre重組酶不存在的情況要短時(shí)，目的基因由于其編碼方向新術(xiàng)與啓動子方向(xiàng)相反，所以不發(兵畫fā)生表達；在C雨熱re的存在下，LoxP和Lox2272位點對(duì)分别重組，導緻ORF方向術校(xiàng)反轉爲正向(xiàng)，且其中的一對畫但(duì)重組位點將(jiāng)具有相同的方向(到小xiàng)，Cre會(huì)介導産生正向(xi兒匠àng)重組切割，繼而分别留下一個不同的重組位點。&nb新車sp;ORF的方向(xiàng)反轉，使得目的基因可以在啓動子的驅動下木呢正常表達。由于ORF靜醫側翼是兩(liǎng)個不同的鐵報Lox-變體位點，所以即使存在Cre也不會(huì)進(jìn紅拿)一步發(fā)生重組。

雖然該載體系統可用于組織培養細胞，但它更适用于制來師備轉基因動物。當攜帶這(zhè)種(zh醫匠ǒng)載體的轉基因動物與攜帶組織特異性Cre的轉基因動物雜交時(shí)低能，在攜帶兩(liǎng)種(zhǒng)載體的後(hòu)代轉基因動物中，特她錯别是在表達組織特異性Cre的細胞中，目的基因將(jiāng)會(h書月uì)在客戶定制的啓動子驅動下正常表達。

抗性篩選或熒光基因可以添加到該載體中，以便于通新離過(guò)藥篩或者熒光篩選出永久整合外源基因的細胞。

關于該載體系統的更多信息，請參考以下文獻。

參考文獻	主題
Gene. 216:55 (1998)	Characterization of LoxP mutants, inclu農聽ding Lox2272
Nat Biotechnol. 現高21:562 (2003)	Development of the FLEX s照拿witch system
J Neurosci. 28:7視妹025 (2008)	Application of a FLEX 長數switch system

亮點

該載體用于在哺乳動物細胞和動物中，C刀歌re介導的條件性基因表達。目的基因最初處于非表達狀态，通過(guò)Cre重愛匠組酶的共表達後(hòu)目的基因編碼方向(xiàng也拿)發(fā)生反轉而實現永久表達。

優勢

基因激活可控：目的基因ORF的反向(xiàng)放明家置，可防止基因發(fā)生洩漏表達。而某些條件性城房基因表達系統，如LoxP-Stop-Lox一說P表達載體系統，在某些情況下可能(néng)會(huì技讀)有一些低水平的漏表達。

基因穩定激活： 在Cre的存在下，LoxP和Lox2272位點對(duì)分别重組街技，導緻ORF方向(xiàng)永久性地反轉爲正向(xiàng)，數日且其中的一對(duì)重組位點將(jiāng)具有相同的方向(xiàng)著房，Cre會(huì)介導産生正向(xiàng)重組切割，那作繼而在ORF的兩(liǎng)端林說留下兩(liǎng)個不同的Lox-變體，即使存在Cre也不會(huì但月)進(jìn)一步發(fā)生重組，使得目的基因可以在客戶定制的啓動子驅你窗動下正常表達。

技術簡單：常規轉染即可把質粒轉入細胞，相比起(qǐ)病毒載體需要視舞進(jìn)行病毒包裝，過(gu請懂ò)程更簡單。

載體容量非常大：我們的載體總容量可達30 kb，其中質粒骨架隻占3 kb，有足夠大的容量可以拍公放置客戶所感興趣的序列。

高水平表達：常規質粒轉染細胞後(hòu)，可以産生非常高的拷貝數哥近（每個細胞多達幾千拷貝），使外源基因能(n物月éng)高水平表達。

适用于動物體内研究：雖然該載體系統可用于組織培養細胞，但它更适用于制備Cre介導的條件性基因表船購達轉基因動物。

不足之處

載體DNA非整合型：常規質粒在細胞裡(lǐ)主要以遊離DNA狀态存在，所以常規質藍做粒轉染也稱爲瞬時(shí)轉染討音。然而，質粒DNA也可以以非常低的概率永久整合到宿主基因組中（質粒轉染雪事每10²~10⁶個細胞可能(néng)會(huì)有一書路個細胞的基因組被(bèi)整合，整合效率取決于細胞類型）通電。如果將(jiāng)攜帶了藥物抗性基因或者熒光标記基什用因的載體轉到細胞中，在經(jīng)過(guò)擴樂物大和傳代培養後(hòu)，可以使用藥物篩選或細胞分選來獲得穩定整合了該載訊很體的細胞。

可轉染的細胞類型受限：不同類型細胞的質粒轉染效率差異很大。非分裂細胞比分裂身空細胞更難轉染，原代細胞比永生化細胞系更難轉染。一鐘看些重要的細胞類型更是難以轉染，如神經(jīng)元和胰島β細胞。另外，質粒轉錢內染局限于體外細胞實驗，很少運用到活體實驗。

基因拷貝數在不同細胞中呈現差異討頻性：盡管成(chéng)功的轉染可以在單個細胞裡(lǐ)産生非常高的拷貝數，但不光得同細胞間卻有高度的差異性。在一些細胞中，質粒拷貝數非常公術高，而在另外一些細胞卻是低拷貝甚至沒(méi)有那對。而病毒轉導更傾向(xiàng)于相對(du有那ì)均勻地把基因轉到細胞中。

載體關鍵元件

Promoter: The promoter driving兵雜 your gene of interest is pl吃看aced here.

Lox2272: Recombination site for Cre recombin厭紅ase. Mutated Lox site with two音風 base substitutions of男站 wild type LoxP. Incompatible w地見ith LoxP sites. When Cre i廠街s present, the LoxP and LoxP2272 sites跳紙 will be cut and recombine with compati媽鐵ble sites.

LoxP: Recombination site for Cre妹靜 recombinase. I藍窗ncompatible with Lox2272 sites. Wh木吃en Cre is present, the LoxP and Lox2272但長 sites will be cut and 著黑recombine with compat火慢ible sites.

ORF: The open reading frame of your gene外好 of interest is placed明他 here, in an antis我得ense orientation.

SV40 late pA: Simian virus 40 late polyaden路可ylation signal. It fa在南cilitates transcriptional terminat話亮ion of the upstream OR行唱F.

CMV promoter: Human cytomegalovirus immediate early他但 promoter. It drives the ubi服通quitous express農務ion of the downstream marker gen笑工e.

Marker: A drug selection gene 風們(such as neomycin resistance),鐵亮 a visually detectable 秒河gene (such as EGFP), or a dual-rep姐光orter gene (such as EGFP/Neo). This a兒玩llows cells transduced with the v近睡ector to be sele海科cted and/or vis習機ualized.

Ampicillin: Ampicillin resistance gen用司e. It allows the plasmid to be mainta長討ined by ampicillin 外去selection in E. coli.

pUC ori: pUC origin of replication. P匠一lasmids carrying this生裡 origin exist in 但制high copy numbers in E. 新笑coli.

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