Small RNA體外轉錄載體

概述

我們的體外轉錄載體是簡單有效的RNA轉在議錄系統，适用于各種(zhǒng)研究。小RNA體外時見轉錄載體産生的小RNA，适用于生化研究、shRNA敲除或間到CRISPR/gRNA介導的基因編輯等細的拿胞或胚胎注射，以及需要特定短RNA序列的其他光理應用。

該系統利用目的序列上遊的T7啓動子，通過(器喝guò)T7噬菌體RNA聚合酶（T7 RNAP）和志和三磷酸核苷酸，在适當的反應條件下高效生成(chéng)小RNA。我什音們建議您參考已發(fā)表文獻中經(jīng)測試的體外轉錄步驟說(sh議睡uō)明來進(jìn)行體外轉錄。

T7 RNAP對(duì)于有效的轉錄起(qǐ)始具有堿基輛銀要求，且這(zhè)些堿基已經(jīng)被(bèi唱場)放置到載體上。T7啓動子3'末端的前兩東和(liǎng)個堿基是GG，緊接著(zhe)是客戶朋刀的目的序列。

我們的小RNA體外轉錄載體會(huì)這火發(fā)生失控轉錄，這(zhè)意味著(zhe)T7 RNAP的轉錄能(né年吃ng)進(jìn)行到DNA模闆的末端，不會(hu海樹ì)在質粒内的任何特定位點終止。因此，在體外轉錄之前，應通過(guò)使用Sa樂家pI來單酶切線性化環狀質粒。SapI要鐵單酶切位點正好(hǎo)位于目的序列的下遊。值得注意的是，待轉錄的體門序列不能(néng)含有所用線性化酶切位點，以免産生截短務哥的mRNA。不純的酶切産物可能(néng)會件還(huì)抑制随後(hòu)的樹費轉錄反應，因此建議通過(guò)柱子或酚氯仿來快木純化酶切産物。

在體内應用中，許多RNA都(dōu)會(hu你村ì)進(jìn)行5'末端的修飾，稱爲5'加帽。對(duì)于不同的實驗黑技目的，未加帽的體外轉錄小RNA通常能身校(néng)産生良好(hǎo)的實驗效果。請根據您的實驗性質來決定RNA是議問否需要加帽。如果需要，則可以通過(guò)使用帽子類似物慢高共轉錄或使用加帽酶轉錄後(hòu)修飾獲得加帽RNA。

關于該載體系統的更多信息，請參考以下文獻。

參考文獻	主題
Nucleic Acids Res. 7:1931 村答(1979)	Cloning and cha地山racterization of the T7 promoter
Methods Mol Biol. 703:29 (2011)	Protocols for the 銀站synthesis of RNA b對爸y in vitro transcripti線相on
Methods Mol Biol. 941:59 (20在一12)	Preparation of short RN術匠A by in vitro tr員習anscription
Protein Expr Purif. 9:142 (坐錢1997)	Protocol for exp在上ression and purification of T7 RNAP得兵 for in vitro transcrip喝現tion

亮點

我們的小RNA體外轉錄載體能(néng)高效用于T7 RNAP介導的體白熱外轉錄。該載體在大腸杆菌中具有高拷貝複制能(néng)力，務了易于酶切，有助于大量生成(chéng)小RNA。

優勢

效率高：T7 RNAP是高效酶，其介導他工的體外轉錄可大量産生功能(néng)性RNA。

技術簡單：操作簡便，比在細胞中表達mRNA容易，且在細胞中兒討表達mRNA還(hái)需要進(jìn)行轉染和細胞培養。

不足之處

方向(xiàng)特定：該載體系統隻含有單個體外轉錄啓動子靜近，如需要有義和反義轉錄物，則需要兩(liǎng)個載體。

失控轉錄：爲了産生正确有效的轉錄産物，在進(jìn)行轉錄反應之前需要通過(guò)人司限制性内切酶線性化質粒模闆。

載體關鍵元件

T7 promoter: A promoter for the RNA polymerase from得玩 T7 bacteriophage. Drives h技靜igh-level transcription of 吧近the downstream sequence of interest.

Transcribed sequence: Your chosen DNA 內海sequence of interest t放內o be transcribed into RNA i一中s placed here.

SapI: Unique restriction endonucleas草謝e site that can be used靜見 to linearize the plasm行討id prior to in vitr也火o transcription.

pUC ori: pUC origin of replicat費機ion. Plasmids carry歌很ing this origin 湖可exist in high copy numbers in行資 E. coli.

Ampicillin: Ampicillin resistance gene. It allows 服校the plasmid to be m他熱aintained by ampicill他數in selection in E. coli做都.

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