痘苗病毒（VACV）

服務詳情

服務類型

我們提供的VACV載體構建和病毒包裝服務如下：

• 使用VACV BACYAC骨架克隆的VACV載知子體，包括WR毒株和MVA毒株
• VACV病毒包裝

VACV載體克隆

雲舟生物自主研發(fā)的“BACYAC”骨架專門爲VAC來樹V載體克隆而設計。該骨架整合了細菌人工染色體近民（BAC）和酵母人工染色體（YAC）的關鍵元件。BAC相關元件允許該答畫載體可以在大腸杆菌中以BAC形式擴雪下增，而YAC相關元件允許該載體在釀酒酵母中複制BA說我CYAC載體因此可靈活地在大腸杆菌系統和酵母系統中進(jìn坐身)行載體擴增和序列修飾。

EGFP/LacZ報告基因、BACYAC骨架序列、以及痘苗病毒啓動子被銀唱(bèi)克隆到J2R位點之間的TK（胸苷激酶）基因中，以資道獲得減毒重組載體。我們的減毒WR毒株和MAV毒株可以被(bèi)應用喝土于基礎科研、臨床前試驗、臨床研究姐刀等領域。通過(guò)進(jìn)一步直接突變改造，我們還(hái)可以提城綠供減毒程度更高的痘苗病毒。

VACV BACYAC載體的基本設計如圖1所示。

圖1 含有EGFP或LacZ報告基因的VAC湖海V BACYAC骨架

TK：胸苷激酶基因，在重組VACV中失活以産生減毒病毒。

p7.5：痘苗病毒啓動子。VACV在細胞質中複制需要痘苗病毒啓動子。 p7.5 通常朋票用于驅動轉基因表達，因爲它在病毒複制的早期和晚期具有轉錄活性。

LoxP：Cre重組酶作用的重組位點。兩(liǎng)個LoxP之間的序空讀列可以被(bèi)Cre重組酶剪切下來。

ITR：痘苗病毒基因組兩(liǎng)他商端的反向(xiàng)重複序列，帶有VGF基因。

N2：N2基因在病毒早期感染時(shí)表達，抑制宿主免疫過多著(guò)程。

M1：M1基因可防止宿主細胞凋亡，增強病毒生産。

EGFP或LacZ報告基因： CMV啓動子驅動表達的E黃子GFP和LacZ報告基因，用于識别轉染成(chéng短現)功的細胞。

BACYAC骨架：整合了細菌人工染色體（BAC）和酵母人工染色體（YAC）的載體骨金身架，可以在大腸杆菌種(zhǒng)攜帶氯黴素抗性基因選擇性擴刀討增，也可以在釀酒酵母中使用His3自噬選擇标記進(jìn)行擴增。

運輸與存儲

我們的VACV病毒保存于HBSS緩沖液，并以幹冰形式運輸。接收到病毒後(hò你匠u)，VACV可以在-80°C長(cháng頻車)期存儲（可至少穩定存儲6個月），或者在-20°C存儲一周。VACV的謝要保質期約爲1年。請避免反複凍融VACV以避免顯著的滴度下降。學紅

VACV制備與質量控制

VACV包裝流程如圖2所示。攜帶目的基因的非感染性VACA BACYAC載體轉染哺乳動物細胞，同拍腦時(shí)轉導非複制型的雞痘病毒作爲輔助病毒。由于VACV具有廣泛的組織暗藍嗜性，因此可用多種(zhǒng)類型的細胞包裝生産VACV。雲舟生物首先暗員采用多種(zhǒng)類型的細胞用于VACV的複蘇和擴增。我們自農使用嗜斑純化法初步獲得病毒克隆，然後(hòu)進(jìn)行病毒擴增。細胞市微外包膜病毒 (EEV) 和細胞内成(chéng)熟病毒 (雪時IMV) 可以分别從上清液和細胞裂解液中收獲。E很吃EV通過(guò)PEG濃縮後(hòu)，與IMV的病毒液朋關合并。對(duì)于超純化VACV，病毒顆粒經(jīng)過(guò如放)進(jìn)一步的蔗糖密度梯度離心以獲得純化和濃縮。

圖2 典型的VACV包裝流程。

對(duì)于每一個生産的重組VACV病毒，質量控制包括滴度檢測、無菌測試、支說近原體檢測等。如果VACV病毒載體表達熒光蛋白，則我們會(h懂坐uì)進(jìn)行熒光轉導測試。如果VACV病毒載體女吃含有藥篩标記，我們也會(huì)在轉導月內測試後(hòu)伴随進(jìn)行藥篩測試。此外，對(du飛區ì)于超純化VACV，我們會(huì)進(jìn)行内雜兒毒素檢測。

試驗驗證

我們的VACV載體經(jīng時到)詳盡驗證可以穩定用于生産活病毒。 圖3顯示了經(jīng)我們性能(néng)驗證做化的VACV病毒轉導BHK21細胞的老公效果。

圖3 表達EGFP的VACV轉導BHK21細胞，MOI=0.5。轉導後費說(hòu)0小時(shí)和72小時(shí)使用熒光文雜顯微鏡成(chéng)像。放大倍數：100×。左：明錢些場。右：EGFP。

VACV背景知識

VACV是一種(zhǒng)雙鏈線性DNA病毒，屬于痘病毒家族。它的基因組長(劇書cháng)度約爲190 kb，可以插入大型說暗轉基因（25-30 kb）。VACV的基因組複制和轉錄完全發(fā)生在宿主細舊麗胞的細胞質中，病毒基因組編碼DNA複制和RNA轉錄所需的所有區現蛋白質。因此，VACV的病毒生命周期對(duì)宿主細胞機制的依嗎做賴非常小。

在病毒生命周期的早期階段，會(huì)産生許多書熱免疫調節蛋白，幫助病毒從宿主的病毒雪紙防禦機制中逃脫。成(chéng)熟的很見VACV主要有兩(liǎng)種(zhǒng)形式：在細胞裂解時(s說劇hí)釋放的細胞内成(chéng)熟病毒 (IMV) 和通過(guò)胞吐作用體船釋放的細胞外包膜病毒 (EEV)。這(zhè)兩(liǎng)種歌熱(zhǒng)形式都(dōu)能(néng)生生夠通過(guò)病毒脂質膜與宿主細胞膜的融合來感染宿主細胞，而無需與外個宿主細胞表面(miàn)受體結間廠合以進(jìn)行感染。

VACV載體的主要應用

重組VACV載體對(duì)于基因治療是一個富有前景的應用看兵工具，它具有許多優點，比如良好(hǎo)的司師安全性、能(néng)夠容納很大的購輛轉基因、可以感染多種(zhǒng)類型的宿主場拿細胞、可以在增強宿主免疫反應的同時(shí)避免被(bèi)近輛宿主免疫系統靶向(xiàng)清除。

在痘病毒家族中，已經(jīng)開(kāi)發件外(fā)出具有不同感染性能(néng)和複制能(néng)力的化錢多種(zhǒng)毒株，這(zhè)會(hu下劇ì)影響它們在臨床應用中的實際使用。兩(liǎn綠章g)種(zhǒng)非常常見的毒株是WR毒株和MVA毒株。雖章男然MVA由于其減毒特性而更常用于臨照農床場景，但WR的優勢在于具有更高業視的複制效率并且可以更大程度地調節宿主免疫系統。這街窗(zhè)兩(liǎng)種(zhǒng)毒株目前均被(bèi)廣泛用于城西科研和臨床研究。以下是應用了VAC師低V的一些主要研究方向(xiàng)：

腫瘤治療

除了直接裂解腫瘤細胞，VACV還(hái)可以通過(guò)招募有街免疫細胞使其分泌細胞因子來改變計商腫瘤微環境，從而引發(fā)非直接的抗腫瘤免疫反應。爲了學樹保持VACV這(zhè)種(zhǒng)天然的優點并增強其安全性，開錯重組VACV進(jìn)行了特定的基因修飾。以Pexa-Vac溶瘤VA自一CV爲例，其減毒特性是通過(guò)删除病毒TK基因實分東現的，并且該病毒還(hái)表達GM-CSF轉基因訊理以增強宿主免疫反應。該病毒已經(jīng)用于治療睡報多種(zhǒng)實體瘤的臨床書多探索。當前還(hái)存在其它幾種(zhǒng)溶瘤VACV的臨床試小學驗，可見VACV作爲一種(zhǒng)溶瘤治療工具正在快速發(fā)展。海近

疫苗制備

VACV作爲外源抗原遞送系統也相當有效。VAC妹人V可以包裝極大的DNA、作爲天花疫苗具有很長(chán日見g)的應用曆史，這(zhè)些特性使其有利于成(chéng)爲對(duì)但分抗多種(zhǒng)疾病的有力疫苗載體，比如針對(duì)H海和IV和狂犬病。

VACV載體的應用優勢

廣泛的組織嗜性：VACV不具有用于感染特定細胞的表面(miàn)蛋白，而是通過(g他民uò)膜融合的方式感染細胞，使其可以侵入各種(zhǒ藍冷ng)類型的包括分裂與非分裂細胞。

不整合宿主基因組：VACV的短生命周期隻有8小時(shí)，且病毒複制全程在細胞暗書質中進(jìn)行，不具有病毒基因插入宿主基因組的風險。個兵

腫瘤細胞中高複制效率：VACV在腫瘤細胞中可以選擇性地高效率複制，導緻腫瘤細胞裂解。

病毒複制機制獨立：VACV的mRNA轉錄極少依賴宿主細胞的組錢街分，使其可以适應不同類型的宿主細胞。

宿主免疫逃避：VACV具備逃避免疫系統攻擊的能(néng)力拍光，方式包括産生補體控制蛋白結合并抑制宿主白見空細胞，以及利用宿主細胞的細胞膜組分作爲病毒的外包膜。因此VACV可西外以用于不同方式的注射方法從遠端遞送至靶組愛北織或腫瘤位點。

極大的裝載量：VACV具有很大的基因組，可以容納的30 kb算紙的外源基因。

高滴度且高感染性：VACV可以包裝産生很高的滴度，同時(shí)具有良好(hǎo)的黑男感染性，隻需要很低的MOI即可成友影(chéng)功轉導。

視頻

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文檔

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