哺乳動物基因表達VSV載體

概述

水疱性口炎病毒（Vesicular stomatitis virus，VSV）外作載體在研究病毒顆粒入侵宿主細胞、辨認介的友導病毒感染細胞的細胞表面(miàn)受體、篩選病毒抑歌門制藥物以及疫苗開(kāi)發(fā)方面(miàn)有著(zhe)廣泛的應用站白。VSV病毒載體可以高效地利用異源病毒的包膜蛋白進(jìn)行假型化（P我山resudotypted），比如那些需要在高生物安全等級實驗室操作大章的病毒的包膜蛋白。重組VSV在宿主細胞中不能(néng)進(jìn)行超過畫外(guò)一輪的複制，因此可以在生物安全2級（BSL妹暗2）實驗室進(jìn)行相關操作。這(zhè)些特道對點促使VSV病毒載體成(chéng)爲在無需高度隔離下研究高風險病毒侵入細照月胞機制的理想選擇。

野生型VSV屬于彈狀病毒科（Rhabdoviridae），擁有哥黑一條單鏈負義RNA基因組，并且其複制依賴病毒的RNA依賴的科知RNA聚合酶（RNA-dependent RNA po車劇lymerase，RdRp）。VSV的單鏈RNA基因組編碼以下五種(通市zhǒng)蛋白組分：核蛋白（N）、磷酸化蛋白（P）、分些基質蛋白（M）、糖蛋白（G）和飛嗎病毒RdRp的大亞基（L）。VS這錢V病毒顆粒中，其RNA基因組與N核蛋白組成(chéng家問)核糖核酸蛋白（Ribonucleoprotein，RN喝子P）。P和L蛋白則組成(chéng)RdRp，并結合于RNP。VS爸土V感染靶細胞時(shí)，其G糖蛋白誘導細胞發(fā)生内很器吞作用，幫助病毒侵入細胞。G糖蛋白可以介導病毒包膜與細胞膜融合，促使RN區些P和RdRp一起(qǐ)釋放到細胞技工質中。病毒組分進(jìn)入細胞後(hòu)，RdRp以RNP中區議的負義RNA基因組爲模闆立即啓動一級轉錄，船暗而作爲轉錄産物的正義RNA鏈被(b紙謝èi)進(jìn)一步翻譯，用于生産介導地子病毒基因組複制、二級轉錄、病毒組裝和出芽等病毒吧資等功能(néng)的後(hòu)期蛋白。

載體家生産的重組VSV是G糖蛋白基因缺用呢失的，該缺失導緻VSV自我複制缺弟鐘陷的。G糖蛋白基因通常被(bèi)替換爲報告基因（如熒光蛋白基因、場事熒光素酶報告基因或分泌型堿性磷酸酶基因）林從用于病毒的轉導效果測定。生産VSV假病毒主要由三個步驟構成(少做chéng)：1. 使用質粒初步制備VSV；2. 擴增G糖蛋白補全的VSV一國；3. 使用異源病毒的包膜蛋白組裝VSV假病毒。舊討進(jìn)行重組VSV初步制備時(sh好為í)，首先利用大腸杆菌構建一個可轉錄編碼VSV基因組黃多的負義RNA鏈的VSV-ΔG轉移質粒，其轉錄産物作爲R友文dRp合成(chéng)病毒RNA的RN喝日A模闆。該載體與四個輔助載體（分别表達V為站SV N、P、G和L蛋白）共轉染至經(jīng)牛痘病毒接種舊大(zhǒng)的表達噬菌體T7 RNA聚合酶的包裝細胞。T7 間新RNA聚合酶作用于轉移質粒上的T7啓動子，驅動VSV-ΔG基因組轉錄出負義花票RNA。重組VSV在包裝細胞中組裝并釋區服放。收集細胞上清，用其再次感染表達有G糖白地蛋白的包裝細胞，獲得高産量的G糖蛋白補全的重組VSV。VS可商V假病毒随後(hòu)通過(guò)轉導G糖蛋車師白補全的VSV至表達有異源病毒包膜蛋白的藍行包裝細胞的方式制備。

關于該載體系統的更多信息，請參考以下文獻。讀雨

參考文獻	主題
Hum Vaccin Immunothera. 15:熱音2269 (2019)	Recombinant vesicular拿動 stomatitis vector vaccines
Vaccine. 34:6597 (2016)	Risk/benefit asse算中ssment of live viral vaccines based通土 on VSV
Front Microbiol. 2:27音什2 (2012)	Development and ap子店plications of VSV vect畫熱ors
J Virol Methods. 169:365 (2010)	Generation of VSV pseudoty請樹pes using recombinant VSV-delta G
J Gen Virol. 86:2269 (2005)	Generation of VSV pseudotyped 金作with coronavirus spike protein
Virology. 286:263 (200湖少1)	Characterization of VSV pseudotyped w請西ith HCV envelop proteins

亮點

我們的VSV轉移質粒删除了VSV的G糖蛋白基因，因說到此可通過(guò)提供異源病毒包膜糖蛋報湖白的順式元件來組裝VSV假病毒。VSV病毒的細胞嗜性取決于其包膜蛋時技白的類型。經(jīng)過(guò)專門優化，我們的V路分SV轉移質粒可以在大腸杆菌中以高拷貝數方都農式複制，并含有報告基因以用于VSV習嗎假病毒感染靶細胞後(hòu)的轉導效果測定。

優勢

病毒滴度高：我們的VSV載體可用于包裝滴度高達&g劇玩t;10⁸ PFU/ml 的VSV病毒。該滴度範圍的VSV病毒爸刀感染體外哺乳動物細胞時(shí)，足量病老就毒可以獲得100%的轉導效率。

生産上易于擴增：重組VSV可以很方便地幾乎在所湖短有類型的哺乳動物細胞中進(jìn)行擴增制備朋科。

安全性高：重組VSV隻能(néng)在宿主細胞中進(jìn)行一輪複制。使用VSV假病要農毒可以安全地在BSL-2設施中研究高風險病毒（如伊波拉病毒、寨卡病毒、尼員低帕病毒、新冠病毒等）的包膜蛋白。

适用于疫苗研發(fā)：VSV可以引發(fā)體液和細胞免疫，毒性很低，并且在人類群體中得朋隻有很低的血清陽性率。重組VSV是理子現想的用于研制人類疫苗的病毒載體。

不足之處

載體容量有限：VSV基因組長(cháng)度司很爲11 kb，超出該尺度的長(cháng)片段基因或年大多基因插入將(jiāng)降低病毒包裝後(hòu)的病毒滴度，不利于後(h銀讀òu)續應用。

不适用于研究病毒的傳染病模型：由于重組VSV隻能(néng)在宿主細胞錯遠内複制一次，因此對(duì)于實際的病如草毒感染機體過(guò)程的反映能(nén呢分g)力相當有限。

技術複雜：生産重組VSV有相當多的中間步驟，包括從質粒初步制備VS長聽V、斑塊純化、生産G糖蛋白補全的VSV、使用異源病毒的包話些膜蛋白組裝VSV假病毒等。這(zhè)些步驟相對(duì事服)于傳統的質粒轉染要求運用到更線木複雜的技術。

載體關鍵元件

CMV promoter: Human cytomegalovirus immediate early男我 promoter. It can drive high喝我-level transcrip謝樹tion of the downstream viral antig服通enomic RNA in packaging cells.

T7 promoter:&nbs白線p;Promoter from T7 bacte訊歌riophage. The T7 RNA polymerase信船 from the phage reco很麗gnizes this promoter to dri中化ve high-level tr人見anscription of the downstream viral 志長antigenomic RNA.

VSV-N: Nucleoprotein gene of好科 vesicular stomatitis virus的場. Assembles into an intact RNase-大大resistant nucleocapsid as N/RNA pol體放ymer; required for initiating viral商些 genome synthesis.

VSV-P: Phosphoprotein gene of vesicular花亮 stomatitis viru費信s. Functions as a critical compon作內ent of the VSV polyme時議rase complex by positioni機愛ng the large (L) pro北路tein on the N/RNA template an綠她d stimulating viral RNA synthesis 西信with the L protein at 房和both the initiation線到 and elongation steps.

VSV-M: Matrix protein gene of ve視術sicular stomatitis viru新笑s. Associates with the N/R理懂NA nucleocapsid and facili日技tates virus assembly by 公男promoting condensa討冷tion of the ribonucleocapsid.

Kozak: Kozak translation initiation s湖鄉equence. Facilitates translation init南少iation of ATG start codon downstr爸器eam of the Kozak sequence.

ORF: The open reading frame 樂業of your gene of interest is place照是d here.

VSV-L: Large polymerase protein gen雨暗e of vesicular stomatitis virus.多什 Forms RNA-dependent RNA pol歌門ymerase (RdRp) complexe快刀s with the VSV phosphoprotein 著對and catalyzes synthesis of the計也 N, P, M, G, L mRNAs sequ店高entially.

HDV: Hepatitis de跳家lta virus (HDV) antigenome self-cle員問aving ribozyme. 錢歌This ribozyme, when present in 門這the transcript, catalyzes the sel劇中f-cleavage of the transc媽城ript in cis.

T7 terminator: Transcriptional terminati多見on signal from T7 b妹海acteriophage. Allows transcr志村iption termination of RNA transcribed 個微by bacteriophage T7 RNA劇東 polymerase.

BGH pA: Bovine growth hormone 女嗎polyadenylation signal. Tr但飛anscription driven by用暗 the CMV promoter北姐 is terminated within this sequenc低窗e.

pUC ori: pUC origin of replication. Pl她開asmids carrying this origin討術 exist in high copy numbers in E坐民. coli.

Ampicillin: Ampicillin resi很影stance gene. It allows the plasmid舊西 to be maintained by ampicillin selecti腦照on in E. coli.

哺乳動物基因表達VSV載體

概述

水疱性口炎病毒（Vesicular stomati知慢tis virus，VSV）載體在研究病毒顆粒入侵宿主細胞、辨亮商認介導病毒感染細胞的細胞表面(mià著東n)受體、篩選抑制病毒藥物以及疫有放苗開(kāi)發(fā)方面(miàn)有著(zhe)廣購舊泛的應用。VSV病毒載體可以高效地利用異源影房病毒的包膜蛋白進(jìn)行假型化（Presudot商草ypted），比如那些需要在高生物安全等級實驗室動玩操作的病毒的包膜蛋白。重組VSV在宿主細胞中不能(néng)進(jìn)行超過鄉自(guò)一輪的複制，因此可以在生物安全2級（BSL2）地票實驗室進(jìn)行相關操作。這(z呢這hè)些特點促使VSV病毒載體成(chéng相年)爲在無需高度隔離下研究高風險病毒侵入細胞機制的理想選擇。

野生型VSV屬于彈狀病毒科（Rhabdoviridae），擁有要科一條單鏈負義RNA基因組，并且其複制依賴病毒的風作RNA依賴的RNA聚合酶（RNA-de開討pendent RNA polymera電樂se，RdRp）。VSV的單鏈RNA基因組編碼以下五種(zhǒng師舞)蛋白組分：核蛋白（N）、磷酸化蛋白（P）、市照基質蛋白（M）、糖蛋白（G）和病校微毒RdRp的大亞基（L）。VSV病毒顆粒中，其RNA基因組與N核事什蛋白組成(chéng)核糖核酸蛋白（Ribonucleopr學熱otein，RNP）。P和L蛋白則組成(chéng)RdRp，并結合于RNP開國。VSV感染靶細胞時(shí)，其G糖蛋白麗行誘導細胞發(fā)生内吞作用，幫助病毒侵入細胞。G糖蛋頻間白可以介導病毒包膜與細胞膜融合，促使RNP和RdRp一起(qǐ)釋放到細中厭胞質中。病毒組分進(jìn)入細胞後(hòu)，街近RdRp以RNP中的負義RNA基因組爲模闆立即啓動一級轉錄，而暗要作爲轉錄産物的正義RNA鏈被(bèi)進(jìn)一步翻譯，用于生産介導病毒也站基因組複制、二級轉錄、病毒組裝和出芽等病毒等功能(néng)的後(hòu)校會期蛋白。

載體家生産的重組VSV是G糖蛋白基因微木缺失的，該缺失導緻VSV自我複制缺陷的。G糖蛋白基因通常被(bèi)替換爲報告哥舞基因（如熒光蛋白基因、熒光素酶報告基因或分泌型堿性磷酸酶基因）用于舊老病毒的轉導效果測定。生産VSV假病毒主要由愛嗎三個步驟構成(chéng)：1. 使用質粒初步制備VSV；2. 擴增G糖蛋白討熱補全的VSV；3. 使用異源病毒的包膜蛋白船麗組裝VSV假病毒。進(jìn)行重組VSV初步制備水答時(shí)，首先利用大腸杆菌構建一個可轉錄編碼VSV基因組的媽看負義RNA鏈的VSV-ΔG轉移時西質粒，其轉錄産物作爲RdRp合成(chéng)病毒RNA的RN資書A模闆。該載體與四個輔助載體（請長分别表達VSV N、P、G和L日大蛋白）共轉染至經(jīng)牛痘病毒接種(zhǒng)的表達噬菌體T7 RNA票地聚合酶的包裝細胞。T7 RNA聚合酶作用于轉移質粒上的T7啓跳秒動子，驅動VSV-ΔG基因組轉錄出負義RNA。重組VSV在包裝細胞中山近組裝并釋放。收集細胞上清，用其再次感紙都染表達有G糖蛋白的包裝細胞，獲得高産量的G糖蛋白補全的重得也組VSV。VSV假病毒随後(hòu)通過(gu光生ò)轉導G糖蛋白補全的VSV至表達有異源病毒南紅包膜蛋白的包裝細胞的方式制備。

關于該載體系統的更多信息，請參考以下文獻。

參考文獻	主題
Hum Vaccin Immun空問othera. 15:2269 (201理內9)	Recombinant vesicular stomatitis vect民外or vaccines
Vaccine. 34:6597 (2016)	Risk/benefit assessment of live vir制山al vaccines based on VSV
Front Microbiol. 2北弟:272 (2012)	Development and applicat醫業ions of VSV vectors畫件
J Virol Methods. 169:365 (2010)	Generation of VSV pseudotypes usi從新ng recombinant VS農女V-delta G
J Gen Virol. 86:2269大妹 (2005)	Generation of VS件業V pseudotyped with coronavirus spike p資科rotein
Virology. 286:263 (2001)	Characterization of VSV pseudotyped wi樹窗th HCV envelop proteins

亮點

我們的VSV轉移質粒删除了VSV的G糖蛋白基因，因此可通過(guò)提供異用友源病毒包膜糖蛋白的順式元件來組裝VSV假病毒。VSV病毒的細場能胞嗜性取決于其包膜蛋白的類型。經們大(jīng)過(guò)專門優化，我們的VSV轉移質粒可以在大腸杆菌謝筆中以高拷貝方式複制，并含有報告基因以用于VSV行鐘假病毒感染靶細胞後(hòu)的轉導效果測西房定。

優勢

病毒滴度高：我們的VSV載體可用于包裝滴度高達>10⁸ PFU/ml 的VSV病毒。該滴度範圍區有的VSV病毒感染體外哺乳動物細胞時(shí)，足量病毒可媽長以獲得100%的轉導效率。

生産上易于擴增：重組VSV可以很方便地幾乎在所有類型的哺乳動物細胞中進(jìn)行擴樹來增制備。

安全性高：重組VSV隻能(néng)在宿主細胞中進(jì不為n)行一輪複制。使用VSV假病毒可以安全地在BSL內金-2設施中研究高風險病毒（如伊波拉病毒地廠、寨卡病毒、尼帕病毒、新冠病毒等）的包膜蛋白。

适用于疫苗研發(fā)：VSV可以引發(fā)體液和細胞免疫，毒性很低，并且劇人在人類群體中隻有很低的血清陽性率。重組VSV是理想的用于研制人類民頻疫苗的病毒載體。

不足之處

載體容量有限：VSV基因組長(cháng)度爲11 kb，超出該尺度的長(cháng)片船鄉段基因或多基因插入將(jiāng)降低病毒包裝後(hòu)的病毒滴度，不車民利于後(hòu)續應用。

不适用于研究病毒的傳染病模型：由于重組VSV隻能(néng)在宿主細胞内複制一上舊次，因此對(duì)于實際的病毒感染機體過(guò)程的反映能(n報計éng)力相當有限。

技術複雜：生産重組VSV有相當多的中間步驟，包括從質粒初步制備VSV紙刀、斑塊純化、生産G糖蛋白補全的VSV、使用異源黑說病毒的包膜蛋白組裝VSV假病毒等。這(z頻人hè)些步驟相對(duì)于傳統的錯姐質粒轉染要求運用到更複雜的技術動事。

載體關鍵元件

CMV promoter: 器人Human cytomegalovirus immediate e去那arly promoter. It can drive high-level 笑吧transcription of the downs麗視tream viral antigenomic RNA in packagin你車g cells.

T7 promoter: Promoter from T7 bacteriophage. The T7山司 RNA polymerase from 土樂the phage recognizes this promot關器er to drive high-level transcription老風 of the downstream 理鐘viral antigenomic RNA.

VSV-N: Nucleoprotein gene of vesicular st我腦omatitis virus. Assembles i也林nto an intact RNase-resistant nucleoca醫喝psid as N/RNA polymer; required for 街遠initiating viral genome s科北ynthesis.

VSV-P: Phosphoprotein gene of vesicular stom不風atitis virus. Functions as a cri答都tical component of the VSV polym吧吧erase complex by positioning t生商he large (L) protein on the N/RNA t到慢emplate and stimulating viral RNA s舞見ynthesis with the L protein at b志船oth the initiation and elongation s讀少teps.

VSV-M: Matrix protein gene of vesicular 知技stomatitis virus. Associates with the N我看/RNA nucleocapsid and facilitat了件es virus assembl花作y by promoting condensation of the ri森工bonucleocapsid.

Kozak: Kozak translation initiation sequence.亮喝 Facilitates translation initiation o不銀f ATG start codon dow校唱nstream of the Kozak 遠近sequence.

ORF: The open reading fr離身ame of your gene 金他of interest is placed here.

VSV-L: Large polymerase protein ge花舞ne of vesicular stom你影atitis virus. Forms 個體RNA-dependent RNA pol日近ymerase (RdRp) complexes with the VSV 放森phosphoprotein and catalyzes s關船ynthesis of the N, P, M, 服她G, L mRNAs sequentially了車.

HDV: Hepatitis delta 器民virus (HDV) antigenome議下 self-cleaving ribo嗎飛zyme. This ribo家河zyme, when present in the trans一兵cript, catalyzes th白兒e self-cleavage of t農小he transcript in cis.

T7 terminator: Transcriptional termination 視湖signal from T7 bacteriophage. Allows 些雜transcription termination醫討 of RNA transcribed by bacterio門房phage T7 RNA polymerase.

BGH pA: Bovine gr醫些owth hormone polyadenylati少坐on signal. Transcription吃中 driven by the CMV pr鐵對omoter is terminat時國ed within this sequence.

pUC ori: pUC origin of replication. 會文Plasmids carrying this origin exi船人st in high copy numbers報農 in E. coli.

Ampicillin: Ampicillin resista章議nce gene. It allows th行地e plasmid to be maintained by ampicilli火知n selection in E. coli.

Representative vector design

VB ID	Vector name	Descriptions
VB010000-9315gcp	pVSV[Exp]-EGFP	A VSV-ΔG EGFP-expressing plas事城mid.
VB231214-1679juf	pVSV[Exp]-hSNCA[NM_001375286.麗工1]	A VSV-ΔG gene expression pla慢雜smid encoding human synuclein alp動拿ha, which may be involved in presynapt藍呢ic signaling regulation and 不也has been implicated in neurodegenerativ件文e disease.

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