線蟲Cas9表達載體

概述

CRISPR/Cas9（成(ché國靜ng)簇規則間隔短回文重複序列/CRISPR相關蛋白9）系統極多男大地促進(jìn)了多種(zhǒng)物種(zhǒng)的體外和體内基因抑制對影實驗。在細胞内，Cas9核酸酶與引導RNA（gRNA）形成(c如章héng)複合物，該複合物通過(gu你船ò)與基因組中的18-22 nt的同源靶序列直年可接相互作用提供靶向(xiàng)特異性。gRNA與靶位點通過醫老(guò)互補配對(duì)使Cas9定位到靶序列上，在們然後(hòu)切割基因組中的靶位點。Cas9掃描照師基因組并切割與gRNA互補的序用吧列，前提是這(zhè)些序列跟随著(zhe)一段NG開妹G前間區序列鄰近基序（PAM）森友。雙鏈DNA斷裂随後(hòu)被(bèi)HDR或者NHEJ途徑修複，從而體見産生不同大小長(cháng)度的位點突變（堿基插入或缺失）。

使用一個一體化的同時(shí)表達Cas9和gRNA的載體，或者紙媽分開(kāi)表達Cas9和gRNA的載體，些算可以方便地在線蟲中進(jìn)行C吧線RISPR/Cas9編輯。該載體系統屬商金于後(hòu)者，包含一個線蟲密碼子優化的C道問as9基因。該基因位于一個可加強表達的人工啓動子下遊，并以一計銀個包含polyA加尾信号序列的3’ UTR結購音尾。該載體系統可選擇廣泛性啓動子（eft-3 和pie-1）、組織特異性啓動湖議子（spe-11、myo-2、myo-3工媽和rab-3）、以及誘導型啓動子（h章房sp16-2和hsp16-48）。

該載體可以被(bèi)注射到線蟲的遠端車刀性腺，然後(hòu)進(jìn)入生殖細胞細胞核。綠場篩選突變後(hòu)代，獲得突變可遺傳的基因敲除線蟲品系。該載體也可水這以單獨使用。注射線蟲性腺生産Cas9表達的線蟲品系。

關于該載體系統的更新信息，請參考以下文獻。

參考文獻	主題
Genetics. 202:885 (2016)	DNA transformation in C. elegans
Curr Protoc Mol Biol. 1舊購29 (2019)	CRISPR/Cas9 vectors in C.工吧 elegans
Nat Methods. 10:741 (2013)	gRNA design for C. elegans

亮點

我們的線蟲Cas9表達載體經(jīng)過(guò影人)優化，在大腸杆菌中具有高拷貝複制能(néng)力，且對(duì)細爸錯胞具有高效轉染率。該載體表達的Cas9與gRNA好習結合後(hòu)，可以在線蟲中有效地實現基因編輯

優勢

技術簡單：使用顯微注射即可把質粒轉入細胞，相比起(qǐ)病毒載體需要進(j匠從ìn)行病毒包裝，過(guò)程更簡單。.

突變可遺傳：通過(guò)CRISPR/Cas9系統在生殖細胞進(jìn)行基因編喝醫輯，可以獲得穩定的突變可遺傳的線蟲品系。

不足之處

基因拷貝數在不同細胞中呈現差異性：盡管成(chéng)功的轉染可以在單個細胞裡(lǐ)大視産生非常高的拷貝數，但不同細胞間卻有高度的差森近異性。在一些細胞中，質粒拷貝數非常高，紙聽而在另外一些細胞卻是低拷貝甚至沒(méi)有。

PAM要求：CRISPR/Cas9靶位點必須包含NGG序列（使用較多近錯），也叫(jiào)做PAM序列，位于gRN廠你A識别序列3'末端。

關鍵元件

Promoter: The promoter driv窗訊ing your gene of音木 interest is placed here.

Synthetic intron: This is placed p弟金roximal to the promoter to e地河nhance gene expression.

Kozak: Kozak consensus sequence. It i劇爸s placed in front志街 of the start cod短南on of the ORF of i通地nterest to facilitate translation initi弟土ation in eukaryotes.

ORF: The open reading fr微妹ame of your gene of interest, e.g聽煙. C. elegans codon-optimized Cas9 (Ce匠朋Cas9), is placed here.

unc-54 3’ UTR+polyA: 爸家;Myosin-4 3’ UTR with downstream polyA廠區 from C. elegans. It a短錢llows transcripti水農on termination and polyadenylation 睡離of mRNA transcr習有ibed by Pol II RNA polymerase.

Ampicillin: Ampicillin resistance g船唱ene. It allows the plasmid to be 能器maintained by ampi事能cillin selection 票藍in E. coli.

pUC ori: pUC origin of replication. Plasmids 分內carrying this origin exi窗綠st in high copy numbers in E頻鐵. coli.

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