釀酒酵母蛋白表達載體（Episomal）

概述

我們的釀酒酵母基因表達載體系統是基于廣泛使用的p北金YES2載體而構建的，它是一個可用于在酵母中表達重組蛋白，或在為者通過(guò)在酵母中進(jìn)行過(guò)表達以研究基村老因功能(néng)的強大而有效的系統。目的基因可以克隆到花在該載體上，通過(guò)客戶選擇的制作啓動子來介導表達。VectorB樹男uilder上有幾種(zhǒng)可供選擇的标準啓動子，其中之一是來自酵母半費男乳糖激酶（GAL1）基因的強誘導型啓動子，它是酵母重組蛋白表達系計雨統中最常用的啓動子。

在典型的酵母實驗菌株（如INVSc1）中，GAL1啓動子的科司轉錄活性與培養基中的碳源有一定的關系。在葡萄糖存在的情況下，GAL1公車啓動子的的轉錄受到抑制；半乳糖則會(huì)激活該啓動子。因此，通過(g行票uò)簡單地去除葡萄糖的培養基，并用含有海開半乳糖的培養基替代，可以實現目的基因的誘導表達。

或者，將(jiāng)棉子糖作爲碳源。棉子糖既不抑制也不誘技舞導GAL1啓動子的轉錄，即使在棉子糖存在情況下，加入半乳糖也足以激能信活GAL1啓動子。與使用葡萄糖培養基培視從養的細胞相比，半乳糖對(duì)使用含棉子糖培養基培養的細胞物請誘導更快。然而，由于棉子糖無法抑制GAL1事水啓動子，所以該方法會(huì)導緻誘導前目的基因的“洩漏來見”表達。

通常情況下，利用葡萄糖維持培養的細胞經(jīng)半乳糖窗腦誘導後(hòu)約4小時(shí)可檢測到重組蛋白的表達，而用事業棉子糖培養的細胞僅需約2小時(shí)即可。我們建議您設置一個時(sh路資í)間梯度來優化重組蛋白的表達。

該載體系統的更多信息，請參考以下文獻。

參考文獻	主題
Science. 127:28-9 (1958) Mol. Cell. Biol. 4:1985-98 (19村外84) Mol. Cell. Biol. 4:2467-78 (1984)現民	The GAL1 promoter
Cell 40:767-774 (1985)	Induction of gene expression us愛雜ing the GAL1 promoter
Methods Enzymol. 194:1-863.了綠 (1991)	Extensive information about gene ex麗年pression in yeas歌月t

亮點

該載體系統用于在釀酒酵母中組成(chéng)型或誘導型表達目姐開的基因。將(jiāng)GAL1啓動子費下和目的基因克隆到載體上，然後(hòu)通過(guò)向(xiàng)培北白養基中加入半乳糖來誘導目的基因的表達。培養基中的葡萄糖會(hu頻著ì)抑制目的基因的表達，可使用棉子糖作爲替代碳源，它不會(huì)激活和抑制G店拍AL1啓動子。

試驗驗證

圖1 使用我們的遊離體DNA載體在酵母中表達EGFP。（A）攜帶EGFP基因近土的遊離體DNA載體被(bèi)轉化至尿嘧啶營養缺陷型釀酒酵母。EGF司兵P表達使用GPD啓動子驅動。EGFP序列經(jīng)村店過(guò)密碼子優化。（B）使用熒光顯高師微鏡觀察EGFP在轉化後(hòu)的酵母中的表達。

優勢

高水平表達：誘導型GAL1啓動子可以使目的基因高水平表達。

表達嚴謹：在GAL1啓動子的控制下，葡萄糖會(huì)高效抑制目的基得和因的表達，而半乳糖則會(huì)高效激活其表達。

快速誘導：棉子糖培養的細胞誘導後(hòu)約2小友生時(shí)内可檢測到GAL1介導的重組蛋白。

不足之處

潛在洩漏表達：對(duì)于由GAL1啓動子驅動的蛋白表達，棉子糖可以替代葡報用萄糖或者半乳糖用作碳源。然而，棉子糖無法抑制GAL1啓動子的活性請習，這(zhè)會(huì)引起(qǐ)目的商快基因的洩漏表達。葡萄糖可以用于抑制GAL1啓動子的活性。

載體關鍵元件

Promoter: The promoter that drives your ge到事ne of interest is placed here信可. When the inducible GAL1 promoter 快飛is used, galactose wil河得l induce high-level transcription of 大自the gene of interest, w你學hile glucose will strongl你飛y repressed expression.

Kozak: Kozak consensus sequence. It is place銀用d in front of the start codon of the O空林RF of interest because it is believe月討d to facilitate tran習著slation initiation in eukaryote雨樂s.

ORF: The open readin媽家g frame of your gene of 舞習interest is placed here.

CYC1 terminator: Sequence which facil從窗itates transcriptional te熱弟rmination and polyadenylation of mRN會劇A in yeast.

pUC ori: pUC origin of re間線plication. Plasm北小ids carrying this origin 件見exist in high copy numbers in E. col市為i.

Ampicillin: Ampicillin resistance gene. It 票土allows the plasmid to 刀近be maintained by ampicillin selection說去 in E. coli.

Marker: A yeast selectable marker is placed h近得ere. It allows the yeas少市t cells success劇銀fully transformed with the vector to月費 be selected. One commonly 話雪used marker is the orotidine-5'-pho亮音sphate decarboxylase (URA3) gen動匠e, which allows 相國selection of yeast transf理上ormants in uracil or uridine defi房裡cient medium. Additionally, if 5-文飛Fluoroorotic acid (5-FOA)著輛 is added to the media, the 算聽URA3 gene product will conv水劇ert 5-FOA into 5-fluorouracil, wh生理ich is a toxin that will cause工快 cell death, thereby allowing sel短樹ection against yeas喝綠t carrying the plasmid.

2µ ori: Origin of replication whic議從h permits high-copy replication and北她 maintenance in S. cerevisiae.

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