哺乳動物shRNA幹擾piggyBac載體

概述

我們的piggyBac shRNA幹們愛擾載體系統是一種(zhǒng)可穩定幹擾多種(月北zhǒng)細胞類型靶基因表達的簡單而有效的方法。這(zhè)種(zhǒn聽窗g)基于轉座子的系統利用質粒轉染（非病毒轉導）將(jiān服也g)shRNA表達盒永久地整合到宿主細胞兵外基因組中，由人類U6啓動子驅動表從錢達的shRNA將(jiāng)會鐵服(huì)導緻靶基因mRNA的降解。與合成(chéng)siRNA相比老多，piggyBac shRNA幹擾具有明顯的優勢（見下文載體優短地勢）。

PiggyBac shRNA幹擾載體地工系統包含兩(liǎng)個載體動說，一個載體被(bèi)稱爲輔助質粒，負責資我編碼轉座酶；另一個載體被(bèi)稱爲轉座子質粒，包含兩(l新金iǎng)個末端重複序列（TRs）以及兩(liǎng)者之間的被(bèi)轉微習座區域，shRNA表達盒就(jiù)克隆在這(zhè)個區域。

當輔助質粒和轉座子質粒共轉染靶細胞時(shí)，輔助質粒産生的轉座酶將(習數jiāng)會(huì)識别轉座子的兩(liǎng)個TR元件，然後(hòu師要)將(jiāng)被(bèi)轉座區和兩(liǎng)個T數家R元件插入到宿主基因組中。轉座插入通常就數發(fā)生在包含TTAA序列的宿主染色體位點，并在轉座子兩(liǎng)側學話出現TTAA重複序列。PiggyBac屬于遠土II類轉座子，通過(guò)“剪切—紙飛粘貼”的機制移動，從一個地方轉座到另一個地方，而不留下序列本身（恰好跳村(hǎo)相反，I類轉座子是通過(guò)“複制—粘貼”的方式移動我放）。由于輔助質粒是通過(guò)瞬時(shí)我去轉染進(jìn)入宿主細胞的，故會(huì)逐漸嗎樂丢失。随著(zhe)輔助質粒的丢失，表達shRNA的轉座子在宿主基兵器因組中變成(chéng)了永久整合。當這(zhè)些宿不微主細胞再次被(bèi)輔助質粒轉染，整合的轉座子會(huì)再次通過(guò)他朋“剪切—粘貼”的機制移動。

關于該載體系統的更多資料，請參考以下文獻。

參考文獻	主題
Mol Cell Biochem.在但 354:301 (2011)	Review
Cell. 122:473 (2005)	Efficient transpo新紙sition of the pi船人ggyBac (PB) transpo銀數son in mammalian cell雜文s and mice

亮點

我們的PiggyBac轉座子載體與輔助質粒是經(jīng)過(gu笑小ò)優化的，可在大腸杆菌中高拷貝複制，該載河音體系統對(duì)多種(zhǒ要河ng)類型的靶細胞均具有高效的轉導效率。人類U6女開啓動子能(néng)夠驅動shRNA的高動要水平轉錄，同時(shí)，我們經(jīng)過(guò)優化的sh去算RNA莖-環序列可高效形成(chéng)有效的幹擾RNA。

優勢

永久性整合和幹擾：常規質粒轉染隻能(néng)實現外源基因的瞬時(s計得hí)表達，這(zhè)種(zhǒng)外源基因會(h又歌uì)随著(zhe)宿主細胞的分裂而件著不斷丢失，在快速分裂的細胞中顯得尤爲顯著。相反，在都將(jiāng)PiggyBac轉座子載體和輔助質粒一起(要但qǐ)轉染到哺乳動物細胞中，由于轉座子在轉座酶的作用下，轉座子上的DNA就小序列能(néng)穩定地整合到宿主細胞的染色體中。舊筆因此，U6啓動子驅動shRNA的組成(chéng)型家開表達對(duì)靶基因的幹擾是穩定和永久的，信睡這(zhè)對(duì)于某些實驗目标來說(shuō)可能(néng)是一個重樂對要的優勢。如可對(duì)培養細胞或活體幹擾表型進(jìn)行長(c山有háng)期分析，有助于分離具有不同幹擾水平和/或不同表型的克數民隆；當幹擾載體攜帶熒光标記如EGFP時(sh光舊í)，可通過(guò)流式分選具有不同熒光強度店南（熒光強度和整合數量有關，進(jìn)而與幹擾程度有關）的細胞。坐什

可逆性：如果再次使用輔助質粒轉染攜帶PiggyBac shRNA轉座子黃我的細胞，可將(jiāng)表達shRNA的轉座子從某些細胞的基因組中切除歌友，而不留下任何痕迹。但是，這(zhè)種(zhǒn在朋g)情況隻發(fā)生在一小部分細胞中。

技術簡單：通過(guò)常規轉染即可把質粒轉入細胞，小從相比起(qǐ)病毒載體需要進(jìn)行病毒包裝，過信站(guò)程更簡單。

安全性：常規轉染不會(huì)引起(qǐ)與病毒載體相關的安全性問題。

不足之處

轉染細胞類型受限：PiggyBac載體進(jìn)入細胞依賴于轉染。不同類放山型的細胞，其轉染效率差異非常大。非分裂細胞通常比分裂細胞更電麗難轉染，原代細胞比永生化細胞更難轉購腦染，一些重要的細胞類型轉染難度更大，如神經(jīng)元和胰島β細胞間我。另外，質粒轉染主要局限于體外應用，很少應用于體内實驗（美看但可以應用于轉基因動物模型制備）。以上因素在一定程度上制約了pig紅知gyBac系統的應用。

載體關鍵元件

5' ITR: 5' inverted terminal時木 repeat. When a 麗化DNA sequence is flanked by two ITRs,機熱 the piggyBac transpose ca熱會n recognize the河地m, and insert the flanked region inc討村luding the two ITRs into the樹她 host genome.

U6 Promoter: Drives expression of th自間e shRNA. This is the pro短女moter of the human U6 s行船nRNA gene, an RNA polymerase III化家 promoter which efficientl到秒y expresses short RNAs懂現.

Sense, Antisense討為: These sequences are derived哥和 from your target sequences, and are區議 transcribed to f就紅orm the stem portion 訊學of the “hairpin道說” structure of 務長the shRNA.

Loop: This optimized sequence is transcribed 睡這to form the loop portion 草歌of the shRNA “hairpin” structu機影re.

Terminator: Terminates transcription of the shRNA站年.

hPGK promoter: Human phosphoglyc了從erate kinase 1 g飛雜ene promoter. It drives the ubiquitous 人體expression of the downstream mark呢熱er gene.

Marker: A drug selection gene (such as neomy做作cin resistance), a visually detect裡雪able gene (such as EGFP), or a du司答al-reporter gene (such as EGFP們請/Neo). This allows cells tr明師ansduced with the vec員裡tor to be selected and/or visual花吃ized.

rBG pA: Rabbit β-globin polya件刀denylation signal. It f金醫acilitates transcrip算小tional termination吃生 of the upstream marker gene.

3' ITR: 3' inverted terminal r道子epeat. See description for 5’ ITR.

Ampicillin: Ampicillin resistance gene. It 鐵妹allows the plasmid to be麗腦 maintained by a制就mpicillin selection in E. coli.

pUC ori: pUC origin of replication. Plasmids我校 carrying this origin exist in high 光用copy numbers in E. coli.

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