果蠅基因表達雙整合系統載體pUASTB

概述

我們的pUASTB載體系統是一個高效的轉基因果蠅制備和金雜基因表達控制系統。該系統能(néng)夠利了大用果蠅P元件轉座子系統（如pUAST）或噬菌體吃中φC31整合系統（如pUASTattB）并結合強誘導型啓動子Gal4調節轉基因爸街的表達。因此，pUASTB載體系統可用于P轉座子和φC31整合章器酶介導目的基因插入。目的基因會(h兒厭uì)被(bèi)克隆到pUASTB亮西兩(liǎng)個P-元件末端重海火複序列中間和attB重組位點附近的區域。

爲了實現P轉座子介導的插入，將(jiāng)pUASTB質粒和表達P轉座酶的西司輔助質粒共同導入宿主細胞或胚胎中。接著(zhe)，由輔助質粒産紙說生的轉座酶識别pUASTB質粒上的兩(li門新ǎng)個P元件末端重複序列，并將月錯(jiāng)包含兩(liǎng)個P元件白生末端重複之間的序列插入宿主基因組中。

爲了實現φC31整合酶介導的插入，將(jiāng)pUASTB質場是粒和表達φC31整合酶的輔助質粒共同導入宿主線她細胞或含有attP位點的胚胎中。φC31整合酶介導attB和attP位點之人厭間的不可逆重組，導緻pUASTB載體線性化并整合到宿主基因組中。

mini white基因的表達，可藍這以使果蠅的眼色發(fā)生變化，票刀是鑒定轉基因果蠅成(chéng)功與否的标記。

在pUASTB系統中，目的基因將(jiāng)被(bèi)克隆到合成(chén金技g)誘導型啓動子的下遊，該啓動子問爸由5個串聯排列的GAL4結合位點（5xUAS）和hsp70 T喝一ATA box組成(chéng)。目的基因依賴于GA吧是L4的表達，GAL4蛋白在與pUAST輛行質粒上的UAS位點結合後(hòu)會(huì)激活目的基因的轉錄。務妹因此，在沒(méi)有GAL4表達如如的情況下，目的基因保持沉默，但是通就術過(guò)與表達GAL4的果蠅系雜交後(hòu)，在GAL4表達的細胞中美我，目的基因會(huì)被(bèi)轉錄激金年活。

關于該載體系統的更多信息，請參考以下文獻。

參考文獻	主題
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亮點

我們的pUAST果蠅基因表達載體可有效實舞拍現P轉座酶或φC31整合酶介導的基因插入或目的基因民輛GAL4依賴性表達。我們的載體在大腸杆菌中具有高拷貝，可用于高效産生轉基因司爸果蠅。

優勢

特定位點插入：基于φC31的插入具有位點特異性，通常僅發(fā)生小購在attP位點，降低了破壞内源基因或低下插入位點不當影響轉基因表達的風險。

高水平表達：5×UAS/mini_Hs好業p70啓動子可以在誘導狀态下使目的基因高水平鐘畫表達。

選擇性表達: 不存在GAL4的情況下，目的基因的多美轉錄水平很低或沒(méi)有；在GAL4的存在下，則能(néng服術)實現高水平的基因轉錄。

高效：使用φC31整合酶實現種(zhǒng)系轉基因比基藍鐵于P元件的載體系統如pUAST更有效。

不足之處

基因組随機插入：p元件的随機整合，使得插入位點下坐難以定位，基因組位置也有可能(néng)影響轉基因的表達。此外，轉基行雨因插入到基因或基因組内的調控元件可能(néng)影響内源基因。

潛在的洩漏表達：在某些情況下，即使沒(méi)有GAL4，目的基因也會(員拍huì)發(fā)生低水平洩漏表達。

技術複雜：轉基因果蠅的産生需要胚胎注射和飛行飼養，具有一定的技又要術複雜性。

需要attP插入位點：使用pUASTattB載體系統制備轉基因果蠅，需要使用朋小基因組中攜帶attP“著(zhe)陸位林月點”的特異宿主。

載體關鍵元件

P-element 3’ end: Right terminal r花土epeat, or 3' terminal repeat, of the P子市 element. When a DNA sequence is flan和村ked by the 3’ and 5’ P微慢-element terminal repeats, the P trans慢會posase can recognize t頻文hem and insert the flanked region into關農 the host genome.

5×UAS/mini_Hsp7習南0: The Drosophila melanogaster紙都 heat shock protein 70 (Hsp70) 村火minimal promoter放就 fused with five tandem galactos玩煙e upstream activating seq拿街uences (5×UAS). This is a s謝東trong promoter, t玩麗ightly inducible by GAL4.

Kozak: Drosophila Kozak consensus sequence.影多 It is placed in f術放ront of the start codon of the ORF of農著 interest to facilitate tr姐弟anslation initiation in eukaryotes.

ORF: The open reading fram生理e of your gene of interest音刀 is placed here.

SV40 terminator通兒: Simian virus 40 t很笑ranscriptional terminato用現r. Contains the SV40 small T intron裡媽 and the SV40 early polyadenylation sig路遠nal.

attB site: The bacterial a湖舞ttachment site, attB話購, recognized by the bacterioph歌短age φC31 serine integrase. φC31 integr南媽ase can catalyze site-specific int頻自egration of attB-containing店對 plasmids into 機物attP-containing d湖這ocking or landing sites that have been物都 introduced into host 數村genomes.

mini-white: A variant of th喝音e Drosophila white 國服gene. The mini-white gene is 著費a dominant marker for a道為dult fruit fly eye color, which can b理去e used as a reporter to 輛中identify transgen花雜ic events in a white mutant backgrou那大nd.

P-element 5’ end: Left terminal r能窗epeat, or 5' terminal r農村epeat, of the P elem相慢ent. When a DNA 算對sequence is flanked by the 3’ and長為 5’ P-element terminal repeats, the P 的答transposase can reco農也gnize them and insert th飛腦e flanked region into the host ge體費nome.

pUC ori: pUC origin of repl問下ication. Plasmids c離妹arrying this orig議呢in exist in high copy numbers in E. 筆鐘coli.

Ampicillin: Ampicillin resistance ge這紅ne. It allows the plas志農mid to be maintain暗冷ed by ampicillin selection in E.嗎制 coli.

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