杆狀病毒轉移載體（含單啓動子）

概述

杆狀病毒載體系統廣泛應用于昆蟲細胞中表達重組媽為蛋白，它是真核表達重組蛋白最通用和些這最強大的系統之一。該系統特别有利于在真核宿主細胞中大規模地西制備重組蛋白。許多真核生物蛋白的翻譯後(hòu)修飾隻能(司議néng)在真核細胞中發(fā)生（例如糖基化），或者需要真核細胞環新內境來進(jìn)行正确折疊（例如膜蛋白質），而原核舊件蛋白表達系統卻沒(méi)有這(zhè)些功能(néng)。

杆狀病毒是一種(zhǒng)雙鏈DNA病毒，通常會(huì)感染昆蟲，特别銀影是鱗翅目昆蟲（moths, butter綠子flies and skippers）。我們的克隆載體pBV是經(j也光īng)優化的，可與來自AcMNPV（Autographa calif音妹ornica multicapsid nucleopolyh信現edrovirus）的穿梭載體（稱爲B謝錯acmid）一起(qǐ)使用，該穿梭載體的為拿野生型基因組大小爲134 kb。

首先將(jiāng)目的基因克隆到含下科有強啓動子的pBV載體上，目的基因表達草弟盒與慶大黴素抗性基因的側翼序列爲Tn7轉座子末端元件Tn7L和T她話n7R。然後(hòu)，將(jiāng)該載體轉老場化到攜帶Bacmid穿梭載體和輔助質粒的大腸杆菌中。Bacmid穿梭載間小體是一個非常大的質粒，含有經(jīng)修飾後花長(hòu)攜帶lacZ基因的杆狀病毒基因組和插入l錯關acZ基因編碼區的mini-at又著tTn7位點。輔助質粒可以表達Tn7轉座酶，由轉座酶介導pBV載場林體上Tn7R和Tn7L的之間的鐵那區域轉座到mini-attTn7位點，Tn7R和日跳Tn7L的之間的區域是目的基因和慶大黴素抗性基因的表達盒。通兵刀過(guò)慶大黴素篩選和藍/白篩選鑒定出重組的陽性克隆（時長由于lacZ表達，非重組菌落爲藍色，而由于轉座子插入破壞lacZ，重組菌落器年爲白色），純化的重組Bacmid 海船DNA可用于轉染昆蟲細胞以産生活的杆狀病毒，進(jìn)而産生什綠目的重組蛋白。

最常用的杆狀病毒重組蛋白表達細胞系是Sf9，來源于草地貪夜蛾（fall 校相armyworm）的卵巢組織。該細胞系适用于各種(zhǒng)培養條件了門，包括懸浮或單細胞培養以及無血清培影麗養基。幼蟲和其他鱗翅目細胞系也被(bèi)廣泛使用，也坐說有一些關于杆狀病毒可應用于哺乳動物細胞的報道(dào)。

有關該載體系統的更多信息，請參線坐考以下文獻。

參考文獻	主題
J Virol. 67:4566-79 (1993)	Generation of recombin喝事ant baculovirus by site-specific transp妹呢oson-mediated insertio不視n
Meth. Mol Med. 離作13:213-35 (1998器體)	Generation of recombinant bac話員ulovirus DNA in E.coli using a bacul工鐘ovirus shuttle vector
Nat Biotech. 23:離很 567–575 (2005)	Baculovirus as versatile vectors for 好喝protein express些對ion in insect and mammalian cel友讀ls

亮點

我們的杆狀病毒重組蛋白表達載體系統現音能(néng)夠在昆蟲細胞中高效生産重組蛋白，該系統表達的蛋白具有真票你核細胞的翻譯後(hòu)加工特征，且能(néng)算技夠進(jìn)行大規模生産應用。

優勢

真核系統：昆蟲細胞可進(jìn)行類似于哺乳動物細胞的蛋白翻譯後(hò廠員u)加工。因此，我們的系統特别适用于表達需要進(jìn)行适當的轉錄後門花(hòu)加工的真核生物蛋白，而原核表達系統并不具備這城場(zhè)一功能(néng)，如共價修飾或膜定位。

高水平表達和可溶性：在大多數情況下，目的蛋白是高度表快什達的，可溶性的，并且可以很容易商行地從感染細胞中進(jìn)行純化回收。

易于放大規模：在我們的系統中，獲得的初始杆狀病毒可用于感染更多細胞不問以進(jìn)一步提高病毒滴度。因此，利用我們的系統易于放的海大蛋白生産規模。

懸浮培養：Sf9和其他鱗翅目細胞系易于懸浮培養，使其能(né劇微ng)夠在生物反應器中大規模生産店吧重組蛋白。

安全性：杆狀病毒不能(néng)在除了昆雨坐蟲細胞以外的細胞進(jìn)行複制，山市對(duì)哺乳動物和植物無緻病性。因此，時事可以在最小生物安全條件下使用我們的杆狀病毒重組照雪蛋白表達系統。

不足之處

技術複雜：使用杆狀病毒表達系統進(jìn)行蛋水問白生産需要多個步驟，包括將(jiāng)目的基因克隆的師到pBV載體上，産生重組Bacmid，并將(j現在iāng)重組Bacmid DNA轉染昆蟲細胞。相對(議章duì)于細菌重組蛋白表達系統，該系統對(d機話uì)技術要求更高，且耗時(shí)更久。在訂購載體的同時(shí)，可以通過雜會(guò)訂購我們的重組Bacmid制備和場體病毒包裝服務輕松解決這(zhè)些問題小吃。

載體關鍵元件

PH promoter: AcMNPV polyhedrin pr門火omoter. It drives high-level express們廠ion of the gene encoding your音花 recombinant protein.

ORF: The open 海黃reading frame of your gene of interes船金t is placed here.

SV40 early pA: Simian virus 40 early polyadenylation 家姐signal. It facilitates 白你transcriptional termination of the 木喝upstream ORF.

Tn7L: Tn7 transposon l時新eft terminal element. It i影火s recognized by Tn7 tran街空sposase. DNA flan湖麗ked by Tn7R and Tn7L can be transposed 上林by Tn7 transposase into attTn7 木我docking sites.

Ampicillin: Ampicillin resistance 見分gene. It allows the plasmid to be現樂 maintained by ampi化少cillin selection in E. coli.

pUC ori: pUC origin of replication. Pla要樂smids carrying this or雪都igin exist in high co了些py numbers in E. coli.

Tn7R: Tn7 transposon right term行物inal element. It 匠北is recognized by Tn7 tran服他sposase. DNA flanked 數河by Tn7R and Tn7L can be trans金林posed by Tn7 transposase 為美into attTn7 docking sites.

Gentamicin: Gentamicin resi但件stance gene. It allows for drug sele熱森ction of E. coli 上放carrying recombinant件習 bacmids.

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