Probe-RNA體外轉錄載體（用于原位雜交）

概述

我們的體外轉錄載體是簡單有效的RNA轉錄系統，适用于各種見書(zhǒng)研究。長(cháng)RNA體外轉錄載體可用于産生RNA探歌唱針（即核糖核酸探針），用于原位雜交男謝。

該系統結合了T7和SP6啓動子，您的目的序列將(jiāng)被(bè街公i)克隆在這(zhè)兩(liǎng)個啓動子之間。在适當的反應條件和三磷酸核飛房苷酸的存在下，T7噬菌體RNA聚合酶（T7 R為飛NAP）或SP6 RNAP可以促進(jìn)高效合成(chéng)雨林核糖核酸探針。這(zhè)兩(liǎng)個啓動子方舊也向(xiàng)相反，一個啓動子將(jiāng)産生有下看義轉錄物，另一個將(jiāng)産生反義轉錄物。根據醫放插入片段的方向(xiàng)和實驗目的，用戶可以選擇音鄉使用T7 RNAP、SP6 RNAP或兩(liǎng)者一起(qǐ體離)進(jìn)行體外轉錄。T7和SP6啓動子側翼序列也農公可用作PCR擴增或測序的引物結合位點。通過(guò)利用半抗原标記的或熒光基唱對團标記的或是放射性标記的核苷酸進(jìn)行轉錄，以便于原位雜美市交探針定位檢測。我們建議您參考視外已發(fā)表文獻中經(jīng)測試的體外轉錄和原位雜交步驟說媽筆(shuō)明來進(jìn)行實驗。

T7和SP6 RNAP對(duì)于有效筆暗的轉錄起(qǐ)始均具有堿基要求，且這(畫話zhè)些堿基已經(jīng)被(bèi)放很你置到載體上。T7啓動子3'末端知時的前兩(liǎng)個堿基是GG，緊接著(z慢麗he)是客戶的目的序列；SP6啓動子3'門我末端的前三個堿基是GAA，緊接著(zhe)是客戶的目的序列。

我們的長(cháng)RNA體外轉錄載體會(huì)發(fā)生失控轉志多錄，這(zhè)意味著(zhe)T7花哥和SP6 RNAP的轉錄個男能(néng)進(jìn)行到DNA模闆的末端，不會(huì)在質粒内的視海任何特定位點終止。因此，在體外轉錄之前，應單酶切線性化環狀動國質粒。在T7啓動子上遊含有BsiWI、AgeI和AscI單酶切位點；在SP舞海6啓動子的上遊含有AvrII，Xh弟工oI，NotI和SapI單酶切位點，紙農這(zhè)些酶切位點均可以在目的序列的下遊進(jìn)行單酶切。值得注意個她的是，待轉錄的序列不能(néng)含有所兒器用線性化酶切位點，以免産生截短的mR好年NA。不純的酶切産物可能(néng)會(huì)抑制随後(hòu學件)的轉錄反應，因此建議通過(guò)柱子或酚氯仿來放土純化酶切産物。

關于該載體系統的更多信息，請參考以下文獻。

參考文獻	主題
Nucleic Acids Res. 7:1931 (1979)	Cloning and chara通農cterization of the T7 promo輛金ter
Nucleic Acids Res. 21:5480頻什 (1993)	Characterization of the SP6 pro暗什moter
Methods. 52:322 (2010)	Methods for generating RNA 道草probes by in vit黑來ro transcription, and 錯技their use for in 腦去situ hybridization.

亮點

我們的長(cháng)RNA體外轉錄載體能懂是(néng)高效用于T7或SP6&nb書就sp;RNAP介導的體外轉錄。該載體在大腸杆菌哥姐中具有高拷貝複制能(néng)力，易于有件酶切，有助于大量生成(chéng)mRNA。月來

優勢

效率高：T7和SP6 &nb了是sp;RNAP是高效酶，其介導的體外轉錄可大量産生功能(néng)性RNA。化兵

技術簡單：與其他探針合成(chéng)方法相比秒爸，使用質粒模闆進(jìn)行體外轉錄，操作更方便。

雙向(xiàng)性：該載體系統含有兩(liǎng)個體外轉錄啓動子，以相學答反方向(xiàng)分别在目的序列的兩(liǎng)側。客戶可以根據目的序列關友的方向(xiàng)，選擇T7或SP6啓討費動子來合成(chéng)有義或來快反義核糖核酸探針。

不足之處

失控轉錄：爲了産生正确有效的轉錄産物，在進(jìn)行轉錄反應之前需要通過(guò)限章跳制性内切酶線性化質粒模闆。

載體關鍵元件

T7 promoter: A promoter for the RNA po拍多lymerase from T7 b河林acteriophage. Drives high-level trans樂著cription of the downstream sequence近個 of interest. This promoter is in the o笑作pposite orientation見媽 to the SP6 promoter, and will generate什習 a transcript which is the reverse-c做白omplement of that produced from t務內he SP6 promoter usi分這ng the same template個物.

Transcribed seq湖在uence: Your DNA sequen林數ce of interest to be transcribed還校 into RNA is placed here.

SP6 promoter: A promoter for the RNA polymerase紙關 from SP6 bacteriophage. Drives h如好igh-level transcript城吃ion of the downstream sequenc朋都e of interest. This prom木在oter is in the opposite orientat個愛ion to the T7 promoter, and wi店林ll generate a transcri煙跳pt which is the r服民everse-complement of that志們 produced from th風鐘e T7 promoter using the same template.明錢

BsiWI, AgeI, AscI, AvrII,著街 XhoI, NotI, SapI: Unique restriction endonucle體河ase sites that can be used外物 to linearize the plasmid p美呢rior to in vitro transcription從國.

pUC ori: pUC origin of replica頻得tion. Plasmids carrying th舊來is origin exist in h分到igh copy numbers in E. co年近li.

Ampicillin: Ampicillin resistance gene. It allows t金鐵he plasmid to be maintained by am術一picillin selection in 文林E. coli.

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