MSCV逆轉錄病毒基因表達載體

概述

MSCV（Murine stem cell virus，鼠幹細胞病毒的拿）逆轉錄病毒載體系統是一種(zhǒng)非常高效的、能(néng)在胚胎歌件幹細胞（ES）、胚胎癌細胞（EC）、造姐要血幹細胞（HS）及其他哺乳動物細胞系中大量表達目的基因的病毒工具。

MSCV逆轉錄病毒載體衍生于MESV和L近作N兩(liǎng)種(zhǒng)逆轉錄病毒載體，這(zhè)兩(l員山iǎng)種(zhǒng)載體分别是基于鼠PCC4細胞骨髓增生性肉瘤病毒（請女PCMV）和莫洛尼鼠白血病病毒（MMLV）。M樂國SCV包含一個延伸的雜合包裝信号，該信号源于LN載懂他體，同傳統的逆轉錄病毒載體相比市一，病毒滴度更高。此外，MSCV逆轉錄病毒載體包含PCMV病毒來微來源的經(jīng)過(guò)書議設計的5’LTR，有助于靶基因在ES細胞、EC細胞知國等多能(néng)細胞系中的轉錄激活，克服了目的基因在此兩白不(liǎng)種(zhǒng)細胞中抑制性表達如志的現象，而該現象通常能(néng)在MMLV逆轉兵什錄病毒載體中觀察到。

MSCV逆轉錄病毒載體首先構建成照靜(chéng)大腸杆菌質粒。随後(hòu)同輔助質粒一起(qǐ)被(bèi區你)轉染到包裝細胞中。在包裝細胞内，位于兩(liǎng)個長(cháng)末端會中重複序列（LTRs）之間的載體DNA轉錄成(chén近路g)RNA，輔助質粒表達病毒蛋白將(jiāng)RNA包裝成(ch他資éng)病毒。之後(hòu)，活路金病毒分泌到上清中，可用于直接或者濃縮後她地(hòu)感染靶細胞。

將(jiāng)病毒加入靶細胞後舊術(hòu)，RNA穿梭進(jìn)入細胞，反轉錄成(男自chéng)DNA并随機整合到宿主基因花中組中。載體構建時(shí)插入兩(liǎng)個LTRs之間的序列随同其餘船國病毒基因組被(bèi)永久整合到宿主DNA中在兵。

經(jīng)過(guò)改造，MSCV逆轉錄病毒載體缺乏病毒包裝和轉導樂熱必需的基因（這(zhè)些基因由輔助質粒攜帶、或者森樂整合到包裝細胞中）。因此，由該載體紙習産生的病毒由于複制缺陷而具有非常高的生物安全性（這(zhè)意司市味著(zhe)，該病毒隻能(néng)轉導靶細胞而不能河高(néng)在其中複制）。

關于該載體系統的更多信息，請參考以下文獻。

參考文獻	主題
Gene Ther. 1:13裡報6 (1994)	Development of the MSCV vector series民司
Proc Natl Acad Sci U S A.海看 87:9202 (1990)	Development of the MESV retroviral vect唱在or
Biotechniques 7:980 (1989)	Development of LNL6 retrovira得女l vectors
Proc Natl Acad Sci U S A. 們體83:3292 (1986)	Characterization of retroviral muta會兒nts expressed in EC 討員cells

亮點

我們的載體系統經(jīng)優化後(hòu)，能(néng)這草在大腸杆菌中高拷貝複制，活病毒包裝店科滴度高，能(néng)有效的轉導包括ES、EC和HS細村月胞在内的廣泛細胞，且能(néng)有效時請整合到宿主基因組并進(jìn)行轉基因的件師高水平表達。

優勢

載體DNA穩定整合： 由于DNA會(huì)随著(zhe)時(些吃shí)間而流失，因此，傳統的質粒轉染幾乎都(dōu)是瞬時(s麗南hí)將(jiāng)DNA傳遞到宿主細胞國業中。該問題在快速分裂的細胞中尤其顯著。相計遠反，逆轉錄病毒由于能(néng)將(匠光jiāng)病毒載體整合到宿主基因組中，因此傳遞的基因能(n師道éng)在宿主細胞中穩定存在。

宿主範圍廣：我們的包裝系統將(jiāng)VSV-G衣殼蛋白添加到病毒表面(miàn)。兵商該蛋白就(jiù)有廣泛的親和性。因此，能(néng)用地鐵于轉導來源于常規哺乳動物的細胞，包括電爸人、小鼠和大鼠。此外，MSCV中存在源水綠于PCMV的5’LTR元件，經(jīng)設計改造，有助于師地靶基因在ES、EC和HS細胞中高水平表達。這(zhè)明顯優于器錯MMLV逆轉錄病毒載體，因爲在ES和EC細胞中，MML內對V載體表現出目的基因的表達抑制。盡內土管如此，針對(duì)非分裂的細胞，我們愛制的MSCV載體同樣(yàng)表現出了轉導困難（見下文不足之處）匠來。

載體容量大：MSCV逆轉錄病毒載體的容量~8 Kb得爸。在我們的載體中，病毒包裝和轉導必需元件~高森1.9 Kb，剩餘可容納目的DNA範圍~6.1 Kb。由于我們的載體設土數計僅用于插入ORF，該載體能(néng)夠滿足大多購筆數需求。

表達水平高： 5' LTR包含一個強的廣泛表達啓動子，能(néng)還工夠啓動目的基因高水平表達。

基因拷貝數相對(duì)均一：通常情況下，病毒轉導能(néng)夠以一種(zhǒn森近g)相對(duì)均一的形式將(jiāng)載體傳遞到細胞中。相反，傳統的短那質粒載體轉染不均一性較高，造成(c討得héng)了DNA拷貝數在一些細胞中較高，女鄉而在另一些細胞中則較少或者沒(méi)有。

體内外實驗均有效：我們的載體不僅擁有良好(hǎo)的體外細胞轉導能(néng)力，同樣(y少畫àng)适用于動物實驗。

安全性：我們將(jiāng)病毒包裝和轉導所需的基因分别置于幾個輔助質粒或者整合制雜到包裝細胞中，因此由我們的載體所産生的活也請病毒沒(méi)有複制能(néng)力。

不足之處

依賴于5' LTR啓動子：在我們的載體中，目的基因的表達依賴明聽于爲5’LTR的啓動子功能(néng)區。這(zhè)明顯不如允許添加所需的麗人啓動子驅動目的基因表達的慢病毒載體。

病毒滴度适中：我們的載體包裝病毒滴度在未進(jìn)一步濃縮的包裝細報要胞上清中能(néng)達到10⁷ TU/ml。相比于我們的慢病毒載體唱鐘，低了一個數量級。

非分裂細胞轉導困難：我們的載體難以轉導非分裂細胞。

技術複雜：MSCV逆轉錄病毒載體需要在包裝還個細胞中産生活毒，然後(hòu)進(jìn)行病毒也下滴度檢測。同傳統的質粒轉染相比，該方生謝法技術要求高且較爲耗時(shí)。

載體關鍵元件

MSCV 5' LTR: 5' long terminal repeat from PCC4-cell-河小passaged myeloproliferat兵美ive sarcoma virus (PCMV). The L報鐘TRs carry both promoter and polyad店黑enylation function, 的校such that the 5' LTR acts as a promote一謝r to drive the transc習車ription of the viral geno樹書me, while the 3' LTR acts as a p大工olyadenylation signal t文內o terminate the upstream transcript. 子那The 5’LTR derived from the PCM關車V retrovirus in the MSCV vector has b麗照een strategically modif亮日ied to drive the外道 transcriptional也微 activation of 下務target genes in pluripotent cell lines 務微such as ES or EC cells, unlik冷森e MMLV retroviral vectors.

MSCV ψ+: Murine embryonic好討 stem cell virus packaging signal林低 required for the packaging of viral舞藍 RNA into virus.

Kozak: Kozak consensus理銀 sequence. It is placed in front of th匠慢e start codon of the OR長女F of interest because it is bel國們ieved to facilitate tr中舞anslation initiation in eukaryotes.

ORF: The open reading fra長些me of your gene of interest 志但is placed here.藍為 Its expression is driven by the們森 ubiquitous prom飛綠oter function in t購新he 5' LTR.

MSCV 3' LTR: 3' long terminal repea來中t from PCC4-cell-pass樹如aged myeloproliferative sarcoma virus (討物PCMV). Allows packaging of viral RNA in機算to virus. Also facilitates transcriptio長作n termination and mRNA polya窗畫denylation in ES cells and other cell t件銀ypes.

pUC ori: pUC origin of replication. Plasmids 房件carrying this origin exis動現t in high copy numbers i綠懂n E. coli.

Ampicillin: Ampicillin resistance gene劇鐘. It allows the plasmid to be maintain鄉舊ed by ampicillin selection in E. coli黃時.

Representative vector design

VB ID	Vector name	Descriptions
VB010000-9311qyq	pMSCV[Exp]-EGFP習長:T2A:Puro	A mammalian gene expression MSCV retrov還吧irus vector encodin謝去g EGFP and puromycin resistance暗也 (linked by T2A) 電器driven by a 5' LTR promoter.
VB231214-1687esu	pMSCV[Exp]-hITGA2B[NM_000419.5]	An MSCV retrovirus gene expre身木ssion vector encoding human ITGA2B, par拿時t of an integrin receptor that fu去不nctions in the bl懂科ood coagulation syste錢紙m, driven by a 5' LT業呢R promoter.

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