哺乳動物PiggyBac誘導表達載體 (Te件小t-On)

概述

PiggyBac誘導型基因表達載體結合了載體家高效的PiggyB花歌ac載體系統和Tet-On基因誘導表達系統，幫助您在宿主基因藍家組上永久整合可使用四環素誘導表達的GOI表達盒。

Tet-On基因誘導表達載體系統是在哺乳動物細胞中進(jìn)行實時來業(shí)GOI表達的強大工具。我們的Tet-On基因誘導表達載跳吧體系統在無四環素及其類似物（多西環素）的情況下近黃可以做到GOI幾近完全沉默并且在加入四環素及其類似物（多西環素）的情況下快速森煙響應實現GOI表達。這(zhè)是區東通過(guò)tTS和rtTA蛋白響應四環素及其類似物（多西環素）短亮的基因調控功能(néng)實現的。當不存在四環素及其類輛跳似物（多西環素）的情況下，目的基因幾乎或完全沉默；當往體系中添加四環素或其他輛村類似物（多西環素）時(shí)，目的基東體因得到快速高水平表達。四環素不存在的情況下時(shí)，衍生于TeR（Te亮紅t抑制蛋白）和KRAB-AB（Kid-1蛋白轉錄抑制結構域火冷）的融合蛋白tTS結合TRE啓動子，導緻基因通哥轉錄抑制。另一方面(miàn)，四環素存子小在時(shí)，衍生于突變型Ter抑制蛋森多白和VP16蛋白（轉錄激活結構域）的融合蛋白rtTA結合TRE上微啓動子，激活基因轉錄。

PiggyBac系統包含兩(liǎng)個相動組分，一個組分爲PBase轉座酶（通常爲表達PBase的IVT mRNA）；另唱這一個組分被(bèi)稱爲轉座子質粒銀來，包含兩(liǎng)個末端重複序列（TR）以及兩(liǎng)者之間志習的被(bèi)轉座區域，需要被(bèi)轉座到宿主基因組錢機中的目的基因就(jiù)克隆在這(zhè)個區域。

當表達PBase的IVT mRNA北術和轉座子質粒共轉染靶細胞時(shí)，PBase IVT mRN離高A産生的轉座酶將(jiāng)會(h長們uì)識别轉座子的兩(liǎng)個TR元件，然後(hòu)將(jiā時討ng)被(bèi)轉座區和兩(liǎ農聽ng)個TR元件插入到宿主基因組中。轉姐醫座插入通常發(fā)生在包含TTAA序列的宿主染色體位點，遠紙并在轉座子兩(liǎng)側出現TTAA重複序列。

PiggyBac屬于II類轉座子，通過(guò)“剪切—粘貼”的機制門空移動，從一個地方轉座到另一個地方，而不留下序列本身（化票恰好(hǎo)相反，I類轉座子是通過(guò)“複制—粘貼”的方式報那移動）。由于輔助質粒是通過(guò)瞬時(shí)轉染進(jìn)入妹場宿主細胞的，故會(huì)逐漸丢失。随著(zhe)輔助質粒的丢失，火知轉座子在宿主基因組中變成(chéng)了永久整合。當這(能腦zhè)些宿主細胞再次被(bèi個內)輔助質粒轉染，整合的轉座子會(hu火個ì)再次通過(guò)“剪切—粘貼”的機制移動。

關于PiggyBac基因表達載體系統林弟的更多信息，請參考以下文獻。

參考文獻	主題
Mol Cell Biochem. 354:301 (20如們11)	Review on the piggyBac system
Cell. 122:473 (20影月05)	Efficient transpositio媽睡n of the piggyBac (PB) transp公鄉oson in mammalian cells and mice老銀
Science. 268:1766件又-9 (1995)	Development of rtTA.
J Gene Med. 1:4-1金多2 (1999)	Development of tTS.

亮點

我們的Tet-On誘導型基因表達載體旨在—當缺乏四環素時(shí)，實現目的日的基因的幾乎或完全沉默；當往體系中村窗添加四環素時(shí)，目的基因得到快速高水平表達。我們西那的PiggyBac誘導表達載體系統以及其農視輔助質粒已經(jīng)過(guò)優化，其在大市你腸杆菌中具有高拷貝複制能(néng)力，且對(duì)細胞具有高效轉染率。

優勢

類似開(kāi)關的嚴格基因表達調作海控：隻依賴rtTA的Tet-on系統在沒(méi)有誘導劑的情況下，會(huì)有好呢明顯的洩露表達。我們的Tet-On基因表達載體可嚴格調控基因的表達好理，在沒(méi)有誘導劑的情況下可將請路(jiāng)背景洩露表達最小化，并保持該系統對(duì)四環素誘導的高靈敏度外看。

外源基因的永久整合：常規質粒轉染隻能(néng)實現外源基因的瞬時(s一下hí)表達，這(zhè)種(zhǒng)外源基因會(huì)随著都匠(zhe)宿主細胞的分裂而不斷丢失，在快速分裂的細胞中雨道顯得尤爲顯著。相反，將(jiāng)PiggyBac轉座子載算話體和輔助質粒一起(qǐ)轉染到哺乳動物細胞中，由于轉座子在轉座高訊酶的作用下，目的基因能(néng)穩定地整合到宿主細胞的染色體中，從而實河飛現轉座子載體上攜帶的目的基因在宿主細胞中永久表達。

技術簡單：常規轉染即可把質粒轉入細胞，相比起(qǐ)病毒載體需要進(jìn)行病毒包裝醫窗，過(guò)程更簡單。

載體容量非常大：我們的載體總容量可達30 kb，其中質粒骨架和人服Tet-On元件隻占4.6 kb，有足夠大的容量可以放置客戶所感興趣的序列。我些

不足之處

轉染細胞類型受限：PiggyBac載體進(jìn)入細胞依賴于轉染。不同類鐘高型的細胞，其轉染效率差異非常大。非分裂細胞通常比分裂細胞更熱訊難轉染，原代細胞比永生化細胞更難轉場店染，一些重要的細胞類型轉染難度更大，如神經(jīng)元和胰島β細胞。另讀熱外，質粒轉染主要局限于體外應用，刀書很少應用于體内實驗（但可以應用于轉基因動物話問模型制備）。以上因素在一定程度上制約了PiggyBa低上c系統的應用。

載體關鍵元件

5' ITR: 5' inverted terminal repeat. W民男hen a DNA sequence is計要 flanked by two ITRs, the piggy朋離Bac transpose can recognize them, a議光nd insert the flanked re文說gion including the two ITRs int街謝o the host genom外雜e.

TRE promoter: 農長;Tetracycline-responsi愛黑ve element promoter (2nd generation)那匠. This element can be regulated b了喝y a class of transcription factors (e見對.g. tTA, rtTA and tTS花現) whose activities are d對現ependent on tetracycline or its an離刀alogs (e.g. doxycycline).

Kozak: Kozak consensus sequence. It is pl現相aced in front of the start codon of中議 the ORF of interest to facilitate t少鐘ranslation initiati要大on in eukaryotes.

ORF: The open reading frame of your g數你ene of interest 公民is placed here.

rBG pA: Rabbit beta-globin polyadenylation 村是signal. It facil技議itates transcription termination of t火南he upstream ORF.

Promoter: The promoter cho吃靜sen to drive expressio讀機n of the tTS/rtTA cassette電門.

tTS: Tetracycline-cont分裡rolled transcriptional silencer.影地 This protein binds to嗎銀 TRE promoter to actively suppress gen秒費e transcription only in 聽能the absence of tetracycline and its ana朋好logs (e.g. doxycycline).

T2A: Self-cleaving 2A peptide from th民影osea asigna virus that allows工在 multiple protei開事ns to be made from a p近道olycistronic transcript行服 containing multiple ORFs se南愛parated by T2A.鐘商 The cleavage occurs through a putativ秒動e “ribosomal skipping” mecha銀我nism.

rtTA: Reverse tetracycline respo自銀nsive transcript討車ional activator M2 (2nd genera機暗tion). This protein binds to TRE prom制讀oter to activate gene transcrip新風tion only in the prese開你nce of tetracycline 南窗or its analogs (e.g. doxycy拍黑cline). It has higher sens場還itivity to the inducing drug and lower 微鐘leaky activity in the absence o多制f the drug compared t靜他o its predecessor.

SV40 late pA: Simian virus 40 西些late polyadenylation signal. It faci男遠litates transcriptional termination of 些化the tTS/rtTA cassette.

3' ITR: 3' inverted terminal repeat.窗姐

Ampicillin: Ampicillin resistance票下 gene. It allows the plasmid 上可to be maintained by amp些可icillin selection in E. c兵我oli.

pUC ori: pUC origin of repli媽拿cation. Plasmids carrying this ori歌區gin exist in high copy numbers in E. co體在li.

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