哺乳動物Cas9表達慢病毒載體

CRISPR/Cas9（規律成(chéng)簇的間隔短回文重複序列及店去相關蛋白9）核酸酶表達載體屬于幾種(zhǒng)新興的基因組編輯工具之一睡理（另外兩(liǎng)種(zhǒng)是ZFN和TALEN），可光雨在基因組的靶位點快速有效地産生突票要變。這(zhè)些質粒載體編碼的特異性RNA，看風能(néng)夠引導DNA核酸酶（或缺刻酶）編輯基因組中特定跳森位點的DNA序列。

Cas9是RNA引導DNA核酸酶，是天然原核免疫系統的一部分，賦予細菌産生區新對(duì)質粒和噬菌體等外源遺傳物質的抵抗能(néng)力。黃雪在細胞内，Cas9核酸酶與引導RNA（gRNA）形成(chéng)複草小合物，該複合物通過(guò)與基因組中的18-22nt的同源電光靶序列直接相互作用，gRNA與靶位點通過(guò)互補配對(d時玩uì)使Cas9定位到靶序列上，然後(hòu街秒)切割基因組中的靶位點。爲了方便使用，我們設計的CRIS習道PR/Cas9載體能(néng)夠在一個載體上同時(shí)有效表達Cas9得慢核酸酶（或缺刻酶）和引導RNA（g技大RNA）。

使用CRISPR打靶目的基因需要目标細說畫胞同時(shí)表達Cas9和特異gRNA。這(zhè)可以通過(guò)在說秒同一個載體上共表達Cas9和gRNA，也可以通員科過(guò)在兩(liǎng)個載體各上花化自表達Cas9和gRNA來實現。使用Cas9和gRNA兩空南(liǎng)個載體分開(kāi)表物土達的優勢在于可使用不同的gRNA與不同的Cas9變體組合（如野生型C個照as9，Cas9n，dCas9），這(zhè)也有取決于用戶的實驗目的。此外，使用單獨的Cas9表達載體有利于生産穩轉行亮細胞株或者動物模型，然後(hòu)使用不同的gRNA進(jìn)行打靶。這(z慢金hè)種(zhǒng)方式比起(qǐ)gRNA/Cas9共子文表達載體轉導可以獲得更高的打靶效率。

Cas9表達慢病毒載體可以高效地將(jiāng)Cas9基因通過(g地村uò)病毒顆粒導入使用質粒方式難轉染的哺乳動物細胞。Cas9慢病毒載體首先以票訊質粒的方式構建并使用E. co行間li擴增，然後(hòu)與多個輔助質粒一同轉染至包裝服放細胞。載體上的兩(liǎng)個LTR區域之間的DNA序列將(通頻jiāng)被(bèi)轉錄成(chéng)RNA，而輔助質粒表達她風的病毒蛋白進(jìn)一步與這(zhè)些RNA組裝形成(chéng)完整音路的病毒顆粒。有活性的病毒顆粒被(bèi)釋放到上清液中。病毒上清液可直接行來轉染或者濃縮後(hòu)轉染細胞。當病要廠毒感染靶細胞時(shí)，病毒RNA被(bèi亮筆)反轉錄成(chéng)DNA，然後(hòu)永久性整合到宿主會女基因組，實現用戶選擇的啓動子驅動下的Cas9蛋白多快表達。

通過(guò)改造優化，我們的慢病毒載體删除對來了與病毒包裝和轉導相關的基因（這(zhè)些基因由輔助質粒進(jì道件n)行表達，用于病毒包裝過(guò)程），使其産生的慢病毒顆粒是他城複制缺陷型的（即病毒隻能(néng)用以轉導細胞但是不通妹能(néng)自我複制），具有很高的生物安全性。

我們提供多種(zhǒng)版本的來源于Stre關又ptococcus pyogenes可吃的SpCas9。這(zhè)其中包括hCas9，人源化的野生型S司河pCas9，能(néng)有效地在靶序列制造鄉計DNA雙鏈斷裂（DSB）；hCas9-DA10，核酸酶突變型話風的人源hCas9，隻對(duì)靶師聽序列的DNA單鏈造成(chéng)切口；dCas9，對美包含D10A和H840A突變，屬于無核酸酶活性的SpCas9；SpCas9-H筆司F1，親和性強化的SpCas9；以及eSpCas匠新9，特異性強化的SpCas9。dCas9融合轉錄激活體我結構域如dCas9/VP64和dCas9/VPR，或者融合轉錄家多抑制結構域後(hòu)，如dCas9/KRAB，可分别應用于CRIS開低PRa和CRISPRi系統。此外，我們提供的來源于Stap睡工hylococcus aureus的SaCas9，其序列要比SpCas9和道大來源于Acidaminococcus的AsCpf1更短（A媽山sCpf1屬于新一代CRISPR土不基因編輯系統。AsCpf1造成(chéng)DSB時(shí)，兩(liǎ相裡ng)條DNA鏈上的切口位置相互錯開(k多火āi)，形成(chéng)粘性末端）。

關于該載體系統的更多信息，請參考以下文獻。

技術複雜：使用慢病毒載體時(shí)，需要在包裝湖快細胞中産生活病毒，然後(hòu)測定病毒滴度。因此慢病毒轉染相對(duì)于常相話規質粒轉染，技術難度更高，周期更長(cháng)。

PAM序列依賴: CRISPR/Cas9靶向雨亮(xiàng)特定位點時(sh從紅í)對(duì)gRNA識别序列3'端的PAM序列有嚴格要求。不同類型吃理的Cas9蛋白需要使用不同的PAM離哥序列。

RSV promoter: Rous sarcoma virus promoter. It d玩姐rives transcription of viral公生 RNA in packaging cells.時朋 This RNA is then packaged int短頻o live virus.

5' LTR-ΔU3: A deleted version of 線上the HIV-1 5' lon快購g terminal repeat. In wildtype lentiv訊電irus, 5' LTR and 3' 長多LTR are essentially identic師司al in sequence.去可 They reside on two ends of the vi水東ral genome and point in the same林也 direction. Upon viral integration, 花服the 3' LTR sequence is copied ont用身o the 5' LTR. The鐵花 LTRs carry both promo章刀ter and polyadenyla很兒tion function, such that in wi呢了ldtype virus, the 5' LTR拍男 acts as a promoter to drive the trans地愛cription of the 去鄉viral genome, while 街關the 3' LTR acts as a polyadenylati個匠on signal to terminat下道e the upstream transcript. On our vecto新紙r, Δ5' LTR is deleted for a影工 region that is r鄉討equired for the LTR's pro對火moter activity normally facilitate訊都d by the viral transc說有ription factor Tat. This does n刀多ot affect the production of viral R機會NA during packaging東劇 because the promoter function is supp南聽lemented by the RSV 唱明promoter engineered upstream of Δ5' LT金討R.

Ψ: HIV-1 packaging s化多ignal required for the packagin黃劇g of viral RNA into virus.

RRE: HIV-1 Rev response elemen拿村t. It allows the nuclear ex你林port of viral RNA by the vira說這l Rev protein durin男視g viral packaging.

cPPT: HIV-1 Centra雪湖l polypurine tr新道act. It creates a "都秒DNA flap" that increases nuc河人lear importation of the viral geno車章me during target c又這ell infection. Th姐區is improves vector鐘兵 integration into the host genome, 計市resulting in higher地內 transduction efficiency.

Promoter: The promoter that drive在亮s the expression of the downstr廠計eam Cas9 gene is placed he火數re.

Kozak: Kozak consensus se個著quence. It is placed in front of t近問he start codon of the ORF of interest章器 because it is believ件對ed to facilitat醫海e translation initi拿慢ation in eukary不制otes.

ORF: The open reading frame of the會少 Cas9 nuclease variant c小熱hosen by the user.

WPRE: Woodchuck hepatit多要is virus posttranscriptional re謝國gulatory element. It enhances viral R花船NA stability in packaging cells, leadin如生g to higher titer of packaged virus.

mPGK promoter: Mouse phosphoglycerat路慢e kinase 1 gene prom南廠oter. It drives th水開e ubiquitous expression the downstream就務 marker gene.

Marker: A drug selection gene懂會 (such as neomycin resistance),兒放 a visually detectable 做電gene (such as EGFP), or a 理頻dual-reporter gene (such as E放章GFP/Neo). This allows cells transduced 就師with the vector to be selected到女 and/or visualized.

3' LTR-ΔU3: A truncated version of the HIV-1 船姐3' long terminal repe暗相at that deletes the 子唱U3 region. This leads to the費拍 self-inactivati鐵好on of the promoter activity 音冷of the 5' LTR upon v計這iral vector integration into t紙事he host genome (since 3為金' LTR is copied onto 5玩劇' LTR during viral inte就錢gration). The polyadenylation signal co黃紅ntained in ΔU3/3' L輛是TR serves to terminates all upstre件農am transcripts produced both d答個uring viral packaging an暗火d after viral integration into the ho房呢st genome.

SV40 early pA: 要分Simian virus 40 early po地體lyadenylation signal. It further facil河輛itates transcriptional termination af海說ter the 3' LTR duri新子ng viral RNA tran樂資scription during packagi理務ng. This elevates the lev子來el of functiona醫裡l viral RNA in packaging cells, thus im玩廠proving viral titer.

Ampicillin: Ampicillin resista資人nce gene. It allows th謝樹e plasmid to be maintained by ampic的舊illin selection in E. coli.

pUC ori: pUC origin of replication. P話她lasmids carrying this origin exis快書t in high copy numbers in E. coli.