冷誘導細菌蛋白表達載體

概述

pCS載體系統是用于在大腸杆菌中低溫（通常15℃）高效表達重微國組蛋白的系統。該載體系統基于大腸杆菌冷休克基因cs煙開pA和部分lac操縱子，是pET和pBAD系統（兩(liǎng)者是在37℃間知表達）的補充。

溫度與重組蛋白質的折疊有關，從而影響蛋白的溶解度和穩定性。因此，許多在3人藍7℃下溶解度和穩定性較差的蛋白，能(néng)在煙為較低溫度下有所改善。當重組蛋白37°C誘導表達的pET或綠玩pBAD載體系統中表達困難時(shí)土制，pCS系統可能(néng)是一種(zhǒng)非常有用的替技鐘代方法。

將(jiāng)目的基因置于pCS載體的你中cspA啓動子、lac操縱子（LacO）和c關技spA的5'UTR和短翻譯增強元件（TEE）的下遊。

由于在37℃下5'UTR非常不穩定，c得見spA啓動子在此溫度下的轉錄非常低效。但當將(jiāng放北)宿主菌轉移至15℃時(shí)，生著5'UTR會(huì)形成(chéng)高度穩定的二級結構。TEE藍匠序列可以通過(guò)核糖體的捕獲視紙來增強目的基因的翻譯起(qǐ)始。

該質粒還(hái)攜帶有LacI天然啓動子和編碼序列，LacI蛋白秒能作用于鄰近cspA啓動子的LacO序列紅新以阻斷目的基因的轉錄。在不存在IPTG的情況下，這(zhè舊在)種(zhǒng)抑制作用可以阻止下遊基因的洩漏城朋表達，而加入IPTG則會(huì相黃)阻斷LacI的抑制作用。IPTG和低笑科溫可以有效地誘導目的基因的表達。

關于該系統的更多信息，請參考以下文獻。

參考文獻	主題
Nat Biotechnol. 22:877 (2004)	Cold-shock induced high-yield煙哥 protein production 體鐘in E. coli
J. Biol. Chem. 274:10079-85	TEE sequence translation enhancement醫刀

亮點

在37℃缺乏IPTG的情況下，pCS載體的大腸杆菌可以在生長(chán體南g)培養基中穩定存在。通過(gu爸算ò)添加IPTG，去除LacI農錢的抑制作用，并將(jiāng)匠司溫度轉換到15℃來激活cspA啓動和穩定cspA 5’-UTR的構象，從志如而誘導目的基因的表達。當目的重組蛋白不能(néng)男窗利用pET或者pBAD系統進(jìn)行表達時(shí)男中，該系統可以作爲替代選擇。一些37°C中不穩定的蛋白刀制或者冷穩定蛋白也推薦使用該系統進(jìn)行表達。

優勢

表達嚴謹：在不存在IPTG的情況下，pCS載體上的目的基因被(bèi)這你強烈抑制；當加入IPTG和溫度降司煙至15℃進(jìn)行誘導時(shí)，目的基因高水平店刀表達。

低溫表達：pCS載體系統允許在低溫下表達重組蛋白，這(zhè新農)對(duì)于許多不能(néng)在其他拍慢細菌表達系統正常表達的蛋白來說(shuō)是一個優勢。呢生

宿主要求：與需要特定重組蛋白表達宿主菌的pET或pBAD載體系統不同，路錢pCS可在克隆宿主（通常是Stbl3）中産生重組蛋白。但是，因爲BL21菌株離日能(néng)夠減少蛋白降解，所以通常作爲蛋白表達的推薦宿主。鄉森

不足之處

表達水平次于pET載體：基于pCS載體系統的重組蛋白鐘請水平低于pET載體系統。

關鍵載體元件

cspA promoter: Promoter of the c煙事old-shock gene cspA木光. It drives transcription of the gene 男什of interest at 購信15°C.

LacO: Binding site for LacI. Thi樂資s element inhibits activity of the cspA民中 promoter when Lac和海I protein is present, preventing le街木aky expression of the人人 gene of interest.中店

cspA 5’ UTR: 5’ untranslated region 厭說of the cspA gen在音e, which destabilizes the mRNA at 南女37°C and becomes什大 highly stable 鐘答at 15°C.

TEE: Translati朋道on enhancing element. This sequence is短快 preferentially bound by 嗎妹ribosomes initi明慢ating translatio下做n, so once bound to the TEE, ribosome火服s are rarely available t一裡o translate other mRNAs.

ORF: The open reading frame of your ge綠家ne of interest is placed her什答e.

cspA 3’ UTR: 3’ untranslated r黑筆egion of the cspA 了筆gene.

Ampicillin: Ampicillin resistance 答呢gene. It allows the plasmid 音通to be maintained by ampicillin selecti什白on in E. coli.

pUC ori: pUC origin of rep西妹lication. Plasmids carrying 店這this origin exist in high cop學上y numbers in E. col長鐘i.

LacI: The E. coli natural promoter煙風 and coding seque站熱nce for the lac repressor. Without IPT一站G present, the LacI protein repress習員es transcription of the 黑票gene of interest from the csp討輛A promoter due 錯跳to the LacO site adja房些cent to the cspA 員暗promoter.

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