哺乳動物基因FLEX條件性表達載體（C月輛re-Off）

概述

在哺乳動物細胞和動物中，該常規質粒FLEX（Flip-Excisio輛生n）條件性基因表達載體系統Cre-off，通過(gu什妹ò)Cre重組酶條件性失活目的基因的高她表達。FLEX Cre-off系統利用位于目的基因兩(liǎng明姐)側的Lox-變體重組位點，在Cre重組酶的調控下目的基因發(f行湖ā)生反轉，目的基因不能(néng)正常表達；而Cre不存在的地鐘情況下，目的基因則正常表達。

FLEX Cre-off系統由兩(liǎng)對(duì)異型Lox-變體重組妹坐位點組成(chéng)，其中野生型序列稱爲LoxP，突變體稱爲Lox答討2272，分别位于ORF的兩(liǎng)側。兩(liǎng)志年種(zhǒng)Lox-變體都(dōu)可被(bèi)Cre識别，但隻站信有相同的Lox位點對(duì)可以彼此重組，與其他西和Lox-變體不能(néng)進(jìn)行重組。 LoxP和刀大Lox2272位點以交替方式位于ORF兩(liǎng)端，場睡每對(duì)位點互爲反向(xiàng)。Cre重組酶不存在的情況下，飛暗客戶定制的啓動子可以驅動目的基因的正常表達到樂。Cre重組酶存在的情況下，LoxP和Lox老笑2272位點對(duì)分别重組，導緻O司這RF方向(xiàng)反轉爲反向(xiàng)事花，且其中的一對(duì)重組位點將(jiāng)具有相同的方向(xi高農àng)，Cre會(huì)介導産生正年南向(xiàng)重組切割，繼而分别留下一個不同的重組位點。OR吧西F方向(xiàng)的反轉，使得目的基因無法正常表達。由章區于ORF側翼是兩(liǎng)個不同的Lox-變體位點，所以即使存在Cre也市放不會(huì)進(jìn)一步發(fā)生重組。

雖然該載體系統可用于組織培養細胞，但它更适用在大于制備轉基因動物。當攜帶這化作(zhè)種(zhǒng)載體的轉基因動物與攜帶組織特子畫異性Cre的轉基因動物雜交時(shí)，在攜帶兩(liǎng朋玩)種(zhǒng)載體的後(hòu)代轉基因動物中，特别是還銀在表達組織特異性Cre的細胞中，目低資的基因的表達將(jiāng)會又拍(huì)失活。

抗性篩選或熒光基因可以添加到該載體中，以便于通過(gu短學ò)藥篩或者熒光篩選出永久整合外源基因的細胞。

關于該載體系統的更多信息，請參考以下文獻。

參考文獻	主題
Gene. 216:55 (1998)是務	Characterization of LoxP拍中 mutants, including Lox2272
Nat Biotechnol. 21:562 (2笑坐003)	Development of the FLE頻年X switch system
J Neurosci. 28:山森7025 (2008)	Application of a FLEX swi不路tch system

亮點

該載體用于在哺乳動物細胞和動物中，Cre介導的條件性基因表達。目司懂的基因最初處于正常表達狀态，通過(guò)Cre重組酶的共長暗表達後(hòu)目的基因編碼方向(xiàng)發(fā)生反轉而實現永久失我分活。

優勢

基因失活可控：Cre重組酶存在的情況下，ORF方向(x到一iàng)轉爲反向(xiàng)，可防止基因發(fā)生洩漏表達。也計

基因穩定失活： 在Cre的存在下，土放LoxP和Lox2272位點對筆近(duì)分别重組，導緻ORF方向(xiàng)永久性地轉爲反向(xi公請àng)，且其中的一對(duì)重組位點將(聽店jiāng)具有相同的方向(xiàng)，Cre會(huì)請錯介導産生正向(xiàng)重組切割，繼而在ORF的兩(liǎn醫新g)端留下兩(liǎng)個不同的Lox-變體，市校即使存在Cre也不會(huì)進(們內jìn)一步發(fā)生重組，使得目的基因錯裡的表達永久失活。

技術簡單：常規轉染即可把質粒轉入細胞，相比起(qǐ)好土病毒載體需要進(jìn)行病毒包裝，過(g店但uò)程更簡單。

載體容量非常大：我們的載體總容量可達30 kb，其中質粒骨架地車隻占3 kb，有足夠大的容量可以放置客戶所下農感興趣的序列。

高水平表達：常規質粒轉染細胞後(hòu)，可以産生非常高的窗讀拷貝數（每個細胞多達幾千拷貝），使外源基因能務坐(néng)高水平表達。

适用于動物體内研究：雖然該載體系統可用于組織培養細胞，但它更适用于男刀制備Cre介導的條件性基因表達轉基因動物。

不足之處

載體DNA非整合型：常規質粒在細胞裡(lǐ)主要以遊站報離DNA狀态存在，所以常規質粒轉染也稱爲瞬學綠時(shí)轉染。然而，質粒D了海NA也可以以非常低的概率永久整合到宿主基因組中（質粒轉染低國每102~106個細胞可能(néng)會(huì)有一個細胞的基因組被體票(bèi)整合，整合效率取決于細胞北件類型）。如果將(jiāng)攜帶了藥物抗性基因或者熒光标記場錯基因的載體轉到細胞中，在經(jīng)過(guò)擴大和傳代培養後(hòu)，很妹可以使用藥物篩選或細胞分選來獲得穩定整合了文鄉該載體的細胞。

可轉染的細胞類型受限：不同類型細胞的質粒轉染效率差異很大。非分裂細胞比做通分裂細胞更難轉染，原代細胞比永生化細胞系更難轉染。一些重嗎多要的細胞類型更是難以轉染，如神經(jīng)元和胰島β細胞。另外，質粒轉聽唱染局限于體外細胞實驗，很少運用到活體實驗。

基因拷貝數在不同細胞中呈現差異性：盡管成(chéng)功的轉染可以在單個細胞裡(lǐ)産好行生非常高的拷貝數，但不同細胞間卻有高度的差異性區內。在一些細胞中，質粒拷貝數非常高，而在我算另外一些細胞卻是低拷貝甚至沒(méi)有秒務。而病毒轉導更傾向(xiàng)于相對山懂(duì)均勻地把基因轉到細胞中書女。

載體關鍵元件

Promoter: The promoter driving your g劇身ene of interest is placed he老鄉re.

Lox2272: Recombination site for Cre re飛鐘combinase. Mutated Lox s訊頻ite with two base s飛日ubstitutions of w個雜ild type LoxP. Incompatible with LoxP s鄉很ites. When Cre is present, the LoxP 光月and LoxP2272 sites計關 will be cut and recombine w多船ith compatible sites.

LoxP: Recombination s銀高ite for Cre recombinase. Incompatib多玩le with Lox2272 sites. When Cre is pr工和esent, the LoxP and Lox22腦店72 sites will b草機e cut and recombine w城視ith compatible sites多生.

ORF: The open reading frame of y還明our gene of inte快會rest is placed h白又ere, in a sense orientation.

SV40 late pA: Simian virus 40 late poly紙子adenylation signal. It facilit外們ates transcriptiona謝你l termination of the u身刀pstream ORF.

CMV promoter: Human cytomegalovirus immediate early p門樂romoter. It drives the ubiq黃綠uitous expression of the downstr好下eam marker gene.

Marker: A drug selection gene (現通such as neomycin 會請resistance), a visually 弟車detectable gene (such as EGF靜西P), or a dual-reporter 雜化gene (such as EGFP/Neo). This 些費allows cells transduced with 醫東the vector to be selected 動空and/or visualized.

Ampicillin: Ampicillin resistance gene.森朋 It allows the plasmid t件兒o be maintained by ampicillin sel亮唱ection in E. coli.

pUC ori: pUC origin of rep購道lication. Plasmids carrying this origin鐘用 exist in high copy numbers in 市跳E. coli.

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