線蟲gRNA和Cas9共表達載體

概述

CRISPR/Cas9（成(chén黑光g)簇規則間隔短回文重複序列/C美錢RISPR相關蛋白9）系統極大地促進(jìn從道)了多種(zhǒng)物種(zhǒ腦火ng)的體外和體内基因抑制實驗。在細胞草火内，Cas9核酸酶與引導RNA（gR喝個NA）形成(chéng)複合物，該複合物通過(guò)與基城算因組中的18-22 nt的同源靶序列直接相互作用提供靶向(xiàng服懂)特異性。gRNA與靶位點通過(guò)互補配對(duì)使Cas9定位到靶做歌序列上，然後(hòu)切割基因組中的靶位點。Cas9掃描基因組并和遠切割與gRNA互補的序列，前提是這(zhè)些這工序列跟随著(zhe)一段NGG前間區序列鄰近基序（PAM）。舊綠雙鏈DNA斷裂随後(hòu)被(bèi)HDR或者NHEJ途徑修複，從而産生吧自不同大小長(cháng)度的位愛暗點突變（堿基插入或缺失）。

使用一個一體化的同時(shí)表達Cas9和gRNA的載體，或者分開(是會kāi)表達Cas9和gRNA的載體，可以方便地在線能光蟲中進(jìn)行CRISPR/Cas9編輯。該載體系看音統屬于前者，一個載體上同時(shí)睡購表達gRNA和一個線蟲密碼子優化的Cas9（Ce船答Cas9）。該載體可以被(bèi)注妹靜射到線蟲的遠端性腺，然後(hòu)進(jìn)入生殖細胞細新風胞核。篩選突變後(hòu)代，獲得突變可遺傳的基因敲除線蟲品系。

爲了實現在線蟲中的高效CRISPR基因編輯，雲舟生答老物開(kāi)發(fā)了gRNA和Cas9共要謝表達載體。該載體的gRNA在線蟲密碼子優化的U6啓動子下驅動表達。關林在gRNA終止子的下遊，線蟲強啓動子eft-3被(bèi)用于驅動CeCas司計9表達，并帶有一個包含polyA加尾信号序列的3’ UTR。

關于該載體系統的更新信息，請參考以下文獻。

參考文獻	主題
Genetics. 202:885 (201唱舞6)	DNA transformation i窗農n C. elegans
Curr Protoc Mol Biol.可中 129 (2019)	CRISPR/Cas9 vectors in C. e森如legans
Nat Methods. 10:741 (2遠窗013)	gRNA design for C. elegans

亮點

我們的載體系統已經(jīng)過(guò)優化，其在大腸杆菌司店中具有高拷貝複制能(néng)力，且對(duì冷上)細胞具有高效轉染率。該載體可以在線蟲中有效地通過(家場guò)同時(shí)表達gRNA和Cas9實現基店北因編輯。

優勢

技術簡單：使用顯微注射即可把質粒轉入細胞，相比起(qǐ)木那病毒載體需要進(jìn)行病毒包裝，過(guò)程更光紙簡單。.

突變可遺傳：通過(guò)CRISPR/Cas9系統在生殖細胞進(jìn)行基因編輯，通厭可以獲得穩定的突變可遺傳的線蟲品系。

不足之處

基因拷貝數在不同細胞中呈現差異性：盡管成(chéng)功的轉染可以在單個細胞裡(lǐ)産生非常高的拷貝數，但冷能不同細胞間卻有高度的差異性。在一些細胞中，質粒拷貝數非常高，而在學數另外一些細胞卻是低拷貝甚至沒(méi)有。

PAM要求：CRISPR/Cas9靶位點必須包含NGG序列（使用較多），也叫(jià是章o)做PAM序列，位于gRNA識别序列3'末端。來件

關鍵元件

CeU6: C. elegans U6 sm還弟all nuclear RNA promoter. It drives str樂錢ong expression levels o遠有f small RNAs.

gRNA: Guide RNA compatible with the Cas9 vari站請ant being used.

Terminator: Pol lll transcription 著房terminator. It allows tr土厭anscription terminatio子很n of small RNA transcribed by 要少Pol lll RNA polymerase.

eft-3: C. elegans ef1ɑ promoter. It drives 們到strong expression levels in somati在工c cells.

Kozak: AKozak consensus seque要業nce. It is placed in front of 長問the start codon of the ORF of int舊服erest to facilitate translation initi下區ation in eukaryotes.

CeCas9: CRISPR-associated endonuclease that快務 cuts DNA at a location specified by g器懂RNA. This S. pyogenes草通 Cas9 is codon-optimized for C. elegan會街s and contains multi姐站ple synthetic introns,視站 a carboxy terminal nu刀好clear localization signal, and 問見an HA tag.

unc-54 3’ UTR+po為員lyA: Myosin-4 3’ UTR with雪筆 downstream polyA 微畫from C. elegans. It al慢厭lows transcription term工厭ination and polyadenyla弟校tion of mRNA transcribed by Pol II RN日紙A polymerase.

Ampicillin: Ampicillin resistance gene.麗要 It allows the pl如東asmid to be mainta事麗ined by ampicillin selection in E. 師老coli.

pUC ori: pUC origin of re工紅plication. Plasmids carryin車車g this origin exist in high copy n公小umbers in E. coli.

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