gRNA打靶效率檢測載體

CRISPR/Cas9載體屬于幾種(zhǒng)新興的基因組編輯工具之一，可少請以快速有效地在基因組的靶位點産生突變（另外兩(liǎn紙村g)種(zhǒng)應用廣泛的懂場是ZFN和TALEN）。這(zhè)些質粒載體編碼序列特異性RNA介導的兵校DNA核酸酶（或切口酶），可用于編輯基員睡因組中特定位點的DNA序列。

Cas9屬于RNA引導的DNA核酸酶，是天然原核免疫系統的一習家部分，賦予細菌對(duì)質粒和噬菌體等外源遺傳物質的抗性。在細胞内，Cas線照9核酸酶與引導RNA（gRNA）形成(chéng)複北門合物，該複合物通過(guò)與基因組中的18-22著山 nt的同源靶序列直接相互紅又作用提供靶向(xiàng)特異性舊分。gRNA與靶位點通過(guò)互補配畫議對(duì)使Cas9定位到靶序列上可國，然後(hòu)切割基因組中的靶位點。

常規質粒gRNA特異性檢測載體設計用于測試CRIS書看PR/Cas9對(duì)一個或多個gRNA靶序列的切割效率呢書。該系統允許用戶通過(guò)比對(duì)多個gRNA靶放日位點來篩選出最有效的CRISPR/Cas9靶點。

常規質粒gRNA特異性檢測載體系統的基礎志資是位于強啓動子EF1A下遊的無活性且分隔開(kāi)的EGFP ORF。將(j得城iāng)待測試的gRNA靶位點克隆在兩(liǎng北開)個不完整的無功能(néng)性的EGFP ORF（稱爲EGFP-L和E劇黃GFP-R）之間。EGFP-L由EGFP公但 ORF的上遊468 bp組成(chéng)，事錯EGFP-R對(duì)應于EGFP ORF下遊的268 b個呢p-720 bp。EGFP-L的3'末端的200 村雜bp與EGFP-R的5'末端的200 bp具有序列同源性。

當常規質粒gRNA特異性檢測載體單獨轉染到細胞中時(shí)，不放生會(huì)觀察到綠色熒光，因爲在男EGFP-L和EGFP-R都(dōu)不編碼功能(néng海愛)性熒光蛋白。然而，如果將(jiāng)該載體與Cas9和相應的gRNA載子可體一起(qǐ)共轉染到細胞中，則gRNA-Cas9複合物將(jiāng跳關)被(bèi)募集到EGFP-L和EGFP-R之間的gRNA靶雪吧序列，從而切割産生雙鏈DNA斷裂（DSB），随後(hòu)EGFP-L和E現畫GFP-R的同源區域發(fā)生同都黃源重組。同源重組將(jiāng)産生完整的功能(néng)性EGFP ORF爸金，繼而産生綠色熒光蛋白。在該系統中，可以看問在EGFP-L和EGFP-R之間串聯克隆多個gRNA靶位點音車（每個都(dōu)應包含PAM序列），行銀并且可以通過(guò)與Cas9和船路相應的gRNA共轉染分别測試。通過(guò)分析著唱産生EGFP熒光細胞的效率，比較不同gR的的NA靶位點被(bèi)CRISPR/Cas9切割的效率。

關于該載體系統的更多信息，請參考以下文獻。

該載體系統設計用于通過(guò)觀察月讀EGFP熒光，比較哺乳動物細胞中CRISPR/C議喝as9 gRNA的切割效率。該常規載體技術簡刀見單，易于使用。

測試系統簡單：使用該系統分析gRNA靶點切割效率簡單、快速。

靈敏且穩定：即使在拷貝數非常低的細胞中，EF1A強啓動子和EG門訊FP熒光的穩定表達的特性也有助于檢測到熒光信号。

技術簡單：常規轉染即可把質粒轉入細胞，相比起(qǐ)病毒載體需要進(jìn)行病毒包裝，房北過(guò)程更簡單。

系統簡化：在常規質粒gRNA特異性檢測載體中，gRNA靶序列與基城筆因組中目的基因的遺傳背景不同。在進雜月(jìn)行測試時(shí)，gRNA特異性檢測載體可以以要人高拷貝的形式存在于細胞中。在該測試系統中，CRISPR/Cas9對(d年慢uì)靶位點的切割效率可能(néng)在某種(zhǒng)程度上放南會(huì)發(fā)生改變。

無法檢測脫靶效應：該系統僅能(néng)檢測CRISPR/C大木as9對(duì)gRNA靶位點的切割效民在率，而無法提供關于脫靶效應的數據。