線蟲ttTi5605基因座表達載體

概述

對(duì)模式生物秀麗隐杆線蟲（舊鐵C. elegans）而言，在其基因組特定位點引入單議藍拷貝外源基因是一種(zhǒng)常文術見的研究模式。ttTi5605基因座表達載體紙南是一種(zhǒng)經(jīng)過那錯(guò)良好(hǎo)驗證的可用于線蟲的特定位點的外源基因單謝自拷貝插入的高效系統。該系統使用Mos1看女轉座子剪切機制或CRISPR機制向(xiàn快河g)線蟲引入穩定整合的外源基因插入高腦。

Mos1轉座子首先在果蠅（Drosophila mauritiana農白）中被(bèi)發(fā)現。當冷玩前，相當一部分的線蟲種(zhǒng)屬已經(jīng)被(bèi)開(報了kāi)發(fā)出包含确定的Mos1轉座子插慢習入位點。一個例子是基因組ttTi5605區域包含了Mos1位點的線蟲種聽外(zhǒng)屬。使用ttTi5605基因座的的照原因在于在該區域插入序列不會(huì)擾輛頻亂臨近基因的功能(néng)。此外，Mos1轉座子剪切技術可以將(jiān下妹g)外源基因以單拷貝的方式插入基因組，不容易被(bèi)線蟲自身的R木請NAi系統沉默（重複元件序列通常易被(bèi)細胞轉錄抑制）。Mos中路1介導的ttTi5605位點的基因特異性重組需要數用ttTi5605基因座表達載體與一個表達轉座酶能的的輔助質粒共轉染線蟲。通過(guò)熱激法可愛大以激活轉座酶活性，從而導緻Mos1轉座子在線蟲基因組發(fā)生剪切。斷機吃開(kāi)的DNA雙鏈可以被(兒腦bèi)外部提供的序列修複并産生穩定的基因重組。通過(guò)Mos1介導的飛行單拷貝插入（Mos1-medi外懂ated Single Cop麗從y Insertion，MosSCI）技術，到舞目的基因可以被(bèi)整合至線蟲的ttTi5605土在位點。

ttTi5605基因座表達載體車中包含一系列重要元件幫助高效表達目的基因。首先，該載體可以使用多種(zhǒng小友)類型的啓動子如線蟲廣泛性啓動子、線蟲組織特異性啓動費山子以及熱激活蛋白啓動子驅動目的地煙基因表達。線蟲特異性啓動子spec-1、myo-弟木2和 myo-3已被(bèi)證明可以在線蟲中實現目的基因的組織特異性商志表達。其次，該載體也包含一個帶有polyA加尾信号序列的3’ UTR，計文可以轉錄後(hòu)調控蛋白表達。最後(hòu)，載體還(hái)引光會入了一個野生型C. Briggsae線蟲的unc關笑-119基因作爲陽性篩選标記。離舊Unc-119(ed3)突變的線蟲體型小、呈現出運動不協調表型，并且在缺紅兒乏食物時(shí)不能(nén家爸g)進(jìn)入dauer狀電聽态。轉染ttTi5605基因座表達載體後(hòu)，隻有恢複野生型表型書市的線蟲表明轉染是成(chéng)功的。

使用Mos1轉座子産生的DNA雙鏈重組是稀北電少事(shì)件，而更大範圍的基因組修著放飾可以使用CRISPR技術。tt都去Ti5605基因座表達載體也能(néng)應用于Ca商了s9觸發(fā)的DNA同源重組。針對(新術duì)這(zhè)種(zhǒng)應用，一個打靶ttTi器村5605位點臨近序列的sgRNA載體與一個Cas9蛋務還白需要被(bèi)轉染至線蟲體内。

關于該載體系統的更新信息，請參考以下水視文獻。

參考文獻	主題
Nature. 413:70 (2001); Nat Genet. 40: 書刀1375 (2008)	Strong and heat-shock induc湖明ible promoter in somatic cell一笑s and germline
Nat Genet. 40:1375 (2008)	Single-copy insertion of t通器ransgenes in Caenorhabdit器費is elegans
Nat Genet. 40:1375 (20動答08); Worm. 4:e1046031 (2015)	Unc-119 mutant re飛嗎scue selection
Curr Biol. 1476:82 (2008)	Post-transcriptional r為睡egulation of 3' UTR containing 頻知polyA signal

亮點

ttTi5605基因座表達載體可以將(jiāng)外源基因高效插看在入線蟲基因組。連同表達轉座酶的sgRNA/Cas9載體，ttTi5605工玩 Mos1靶向(xiàng)質粒可以實現位點特異的單拷貝外源基因插兵話入。

優勢

載體DNA永久整合：向(xiàng)線蟲轉染普通質粒隻能(néng)實現瞬時(shí)轉黃銀染，外源基因將(jiāng)随時(shí)大員間在宿主細胞内逐漸丢失。而ttTi5605基因座表達公聽載體可以整合轉基因至細胞基因組并穩定表達，可用于大筆基因序列的精确編輯以及構建轉基因線蟲。

技術簡單：向(xiàng)線蟲轉染質粒載體是技術上相對(duì)直接且對(duì)比問你病毒載體需要包裝生産而更爲簡單的方式。可以使用電轉染、顯微注射或者喂讀少食包含質粒載體的大腸杆菌等方式將(jiāng)質粒導入線蟲體内。

不足之處

MosCI系統不能(néng)同時(長小shí)編輯多個基因。此外，使用該系統獲得轉基因動物模型通常需要超過(guò)議可15天。

載體關鍵元件

ttTi5605-LA: Left homology arm (1,336 bp) targeting近船 C. elegans ttTi5快業605 locus.

Promoter: The promoter driving yo樂答ur gene of interest is placed here.鐵化

Kozak: Kozak consensus se木少quence. This is placed in 拿從front of the st民訊art codon of the ORF of i理著nterest to facil村不itate translation initiation in euka什少ryotes.

ORF: The open reading frame 高新of your gene of intere用商st is placed he那高re.

3' UTR+polyA: Allows transcription termination and事遠 polyadenylation of mRNA transcribed開物 by RNA polymerase II. It functions in如腦 somatic and germ cells.

Unc-119(+): Facilitates the use of the unc-119計中 mutant rescue as中對 a selection marker for 河嗎transgene insertions when討和 using C. elegans unc-119 mutants 樹睡as the background事友.

ttTi5605-RA: Right homology arm (1,428 bp) ta說弟rgeting C. elegans ttTi5605 locus黃廠.

pUC ori: pUC origin of replication. Pla票白smids carrying this origin 站笑exist in high c那我opy numbers in 事校E. coli.

Ampicillin: 她銀; Ampicillin resistance gene. It他門 allows the plasmid to議離 be maintained by ampi老事cillin selection in E. co拍費li.

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