AAV基因誘導表達載體（Tet是一-On）

概述

AAV誘導型基因表達載體結合了載體家應用廣泛低購的AAV載體系統和Tet-On基因誘微妹導表達系統，幫助您在體内體外都(dōu)能(néng)進(jìn)行四環素開雪誘導表達實驗。

Tet-On基因誘導表達載體系統是在哺乳動物細胞中進(jìn)行實時音區(shí)GOI表達的強大工具。我們的Tet-O少鐘n基因誘導表達載體系統在無四環素及其類似物（多西環文喝素）的情況下可以做到GOI幾近完全沉默并且在加入四環議來素及其類似物（多西環素）的情況麗地下快速響應實現GOI表達。這(z師討hè)是通過(guò)tTS和rtTA蛋白響應四環素及其類似物（多西環素姐近）的基因調控功能(néng)實現的。當不存在四環素及其類似物（如dox身說ycycline）的情況下，目可志的基因幾乎或完全沉默；當往體系中添加四環素或其他類似物（如d是音oxycycline）時(shí)，目的基因得到快速高水聽花平表達。四環素不存在的情況下時(shí)，衍生于TeR（Tet抑制蛋章熱白）和KRAB-AB（Kid-1蛋白轉錄抑制結構域）的融合蛋白tTS結合TRE唱草啓動子，導緻基因轉錄抑制。另一方面(miàn)，四環素存在時(就員shí)，衍生于突變型Ter抑制蛋白和VP16蛋遠技白（轉錄激活結構域）的融合蛋白rtTA結合TRE啓動子，激活基因電相轉錄。

AAV誘導表達載體首先以質粒的方式構建并煙空使用E. coli擴增，然後(hòu)轉染進(jìn)入包裝細胞。在民錢包裝過(guò)程中，位于兩(liǎng)個反向(xiàng)重複序列（IT喝又R）之間的DNA片段與由包裝細胞表達的病毒蛋白關爸進(jìn)一步包裝成(chéng)病毒顆粒。位于兩(liǎng)個答看ITR之間的四環素誘導基因表達盒包含兩(liǎng)部分：一個四環素響應因子讀地（TRE）啓動子驅動的用戶自定義GOI，以那能及一個一個廣泛啓動子或者組織特異區書性啓動子驅動的tTS/rtTA調控蛋白子路。當病毒轉導宿主細胞時(shí)，兩(liǎng)跳靜個ITR區域之間的序列和其他病毒基因組分由此進好對(jìn)入了靶細胞。GOI的表達可通過(guò醫兵)加入四環素啓動。AAV包裝時(shí)的ITR序列來源于AAV2，這(zh門鄉è)是一種(zhǒng)常用的AAV載體構建方用見式，不影響血清型。另一方面(miàn)，決定血清型的衣殼蛋白基因由Rep/了些Cap包裝質粒編碼。

關于AAV載體的更多信息，請查看我們的AAV載體介紹頁面(miàn)。

關于該載體系統的更多信息，請參考以下對服文獻。

參考文獻	主題
Methods in Enzy. 5河玩07:229-54 (2012)	Review of AAV virology and 的美uses
Curr Opin Pharmacol. 24:59中子-67 (2015)	AAV use in gene therapy, 工姐and serotype di說家fferences
Science. 268:1766-9 (199風學5)	Development of rtT民信A.
J Gene Med. 1:4-12 (1999)	Development of tTS風妹.

亮點

我們的Tet-On基因誘導表達載體系統在無四環素的情況下可北物以做到GOI幾近完全不表達，但是在加入四環素時(shí)快速表場湖達。我們的AAV載體是經(jīng)過(guò)優化冷線的，可在大腸杆菌中進(jìn)行高拷貝複制，是一個林雪包裝病毒滴度高，細胞轉導效率高，轉基因高水平表達的載體系區日統。該載體可用所有已知衣殼蛋白血清議們型的輔助質粒進(jìn)行包裝，包裝湖水出來的病毒具有非常高的轉導效率，且具有極高的生物安全性。

優勢

類似開(kāi)關的嚴格基因表達調控：隻依賴rtTA的Tet-on系統在照算沒(méi)有誘導劑的情況下，會(huì)有明顯的洩露低算表達。我們的Tet-On基因表達載體可嚴格調控基因的表達，在沒民但(méi)有誘導劑的情況下可將對風(jiāng)背景洩露表達最小化，并保持該系統對(時師duì)四環素誘導的高靈敏度。

高水平表達：TRE啓動子可驅動GOI在誘導狀态下高水平表達。

安全性：AAV是可供選擇的最安全的病毒載體，它是複制缺陷的，不會(huì)聽吧引起(qǐ)任何人類疾病。

對(duì)宿主基因組造成(chéng)破壞的低風險性：在轉導進(jìn)入靶細胞後(hòu)，AAV病毒載體在細胞核保持著(zhe嗎作)遊離DNA的狀态，可以降低宿主基因組被(b如森èi)破壞而緻癌的風險，使其成(chéng)爲人類體内實驗的理想載體空爸。

高病毒滴度：利用我們的AAV病毒載體可以包裝成(chéng)高滴度的病毒。我們提供的病日車毒包裝服務病毒滴度可達到>10¹³ GC/ml。

宿主範圍廣：針對(duì)不同來源的常用哺乳動物（如人拿了、小鼠和大鼠）細胞和組織，將(jiāng)我們的AAV載體包會光裝成(chéng)對(duì)其具有雪玩親和性的血清型，可輕易實現高效轉導。但是，某些類型的細胞上我仍然難以轉導（見下文不足之處），這(zhè)與所用的血清型有議在關。

體内外實驗均有效：我們的載體不僅能(néng)用于體内活體動物實她時驗，還(hái)具有體外細胞轉導能木物(néng)力。

不足之處

載體容量小：AAV是我們所有病毒載體系統中裝載量最小的。AAV的兩(liǎng)個呢路ITR之間所能(néng)容納的最大序列長(cháng又機)度是4.7kb。在Tet-On系統中，用于病毒包裝、轉導和四環素誘導的基因舞湖序列另外占用2.1kb，因此留作自定義的GOI長(ch行事áng)度需要小于2.6kb。

難以轉導特定類型的細胞：當利用合适的血清型進(jìn)行包裝務醫時(shí)，我們的AAV載體系統可以轉導下和很多不同類型的細胞，包括非分裂細胞。不同AAV血清型對(duì)人費不同類型的細胞具有不同的嗜性，針對(duì)某種(zhǒng)特定類型的上時細胞需要特定血清型。

技術複雜：使用AAV病毒載體時(shí)，需要在包裝細胞中産生活病毒，然後(hòu)測光微定病毒滴度。這(zhè)些過(guò)程相對(哥快duì)于常規質粒轉染，技術難度更高，周期更長(cháng)。在訂購載體的同間科時(shí)，可以通過(guò)訂購我們的病毒包裝服務輕松解決這(區黃zhè)些問題。

載體關鍵元件

5' ITR: 5' inverted terminal repeat. 身小In wild type virus, 5' ITR 這習and 3' ITR are essentially identical生草 in sequence. T章什hey reside on two ends of件會 the viral genome 河遠pointing in opposite directi她草ons, where they serv飛麗e as the origin of v她能iral genome replication.

TRE promoter: Tetracycline-responsive element prom門女oter (2nd generation). 坐現This element can be regula謝店ted by a class of transcript笑長ion factors (e.g. tTA, r他是tTA and tTS) whose activities ar物妹e dependent on 村舊tetracycline or its analogs (e.g空喝. doxycycline).

Kozak: Kozak consensus sequence麗舊. It is placed in fro海還nt of the start codon愛有 of the ORF of interest to 科志facilitate translation in朋下itiation in eukaryotes.

ORF: The open reading frame of yo視務ur gene of interest is placed錯你 here.

SV40 late pA: Simian virus 40 late polyadenylati年黃on signal. It facilitates transcr雪答iptional termination of the upst為輛ream ORF.

CBh promoter: CMV early enhancer fused to 老歌modified chicken β-actin 飛山promoter. It drives 店又the ubiquitous expr銀輛ession of the downstream tTS/rtT會費A cassette.

tTS: Tetracycline-controlled transcripti地農onal silencer. Th哥微is protein binds to TRE promoter to act跳路ively suppress gene t城裡ranscription only in the absence of t個動etracycline and its analogs (e算上.g. doxycycline).

T2A: Self-cleaving 2A peptide from thosea 區學asigna virus that allows multipl快喝e proteins to be made from a polyci街但stronic transcr志事ipt containing multiple ORFs separat司去ed by T2A. The cleavage occurs 少飛through a putative “ribosomal ski水費pping” mechanism.

rtTA: Reverse tetr微鐵acycline responsive日玩 transcriptional activator M2 (2nd gen上算eration). This protein binds討內 to TRE promoter to activ化好ate gene transcription only知拍 in the presence of te商路tracycline or its an了紅alogs (e.g. doxycycline). It 時信has higher sensitivi拿劇ty to the inducing drug and lower leak場購y activity in the a中拍bsence of the drug com路日pared to its predecessor唱科.

BGH pA: Bovine growth hormone 讀做polyadenylation. It facilitates transcr舊睡iptional termination of the upst低男ream tTS/rtTA cassette.

Ampicillin: Ampicillin resistance gene. It 技麗allows the plasmid to be maint志員ained by ampicillin selection in 得技E. coli.

pUC ori: pUC origin of replication.文家 Plasmids carrying thi行拿s origin exist i吃票n high copy numbers in E. coli.

相關服務

AAV基因誘導表達載體（Tet是一-On）