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哺乳動物基因FLEX條件性表達腺病毒載體（Cre-為來Switch）
概述
FLEX條件性表達腺病毒載體結合了載體家的高效的腺病毒載體系統和Cre就門響應的FLEX條件性基因表達載體，可以幫助您實現在多種黃關(zhǒng)多樣(yàng)的哺乳動物細胞中以腺病毒轉導Cre響費微應的FLEX基因表達調控開(kāi)關。FLEX Cre-Sw間開itch系統的兩(liǎng)個Lox-變體重組位點之間包含做爸一對(duì)反向(xiàng)平行的O子的RF，在Cre重組酶的調控下ORF上慢南的兩(liǎng)個目的基因編碼方向(xiàng)反轉，從而讓一個目的基因從中生激活表達變成(chéng)沉默機光，另一個目的基因從沉默變成(chéng)激活表達。
FLEX Cre-switch系統銀放由兩(liǎng)對(duì)異型Lox-變體重新暗組位點組成(chéng)，其中野生型序列稱爲LoxP，突變體稱爲Lox2間東272，分别位于兩(liǎng)個基因ORF遠術的兩(liǎng)側。 兩(liǎng)個ORF相互反向(xiàng)，其刀是中一個ORF具有正确的讀碼方向(xiàng)（相對(duì)于啓動子）。兩子大(liǎng)種(zhǒng)Lox-變體都(dōu)可被(bèi)Cre美錯識别，但隻有相同的Lox位點對(duì)可以彼此重組，與其他Lox熱少-變體不能(néng)進(jìn)行重組。LoxP和為那Lox2272位點以交替方式位于兩(liǎng)個ORF兩(liǎng)來要端，每對(duì)位點互爲反向(xiàng)。Cre重作坐組酶不存在的情況時(shí)，第一話也個ORF由于其編碼方向(xiàng)與啓動子方向(xiàng)相同，可以她票在客戶定制的啓動子驅動下正常表達，而第二個ORF由于其方向(議說xiàng)相反則無法正常表達。在Cre的存在下畫歌，LoxP和Lox2272位點對(duì)分别重組，導緻兩(liǎng看了)個ORF方向(xiàng)反轉，且其中的一對(duì)重銀事組位點將(jiāng)具有相同的方服務向(xiàng)，Cre會(huì)介導産生正向(xiàng)重身畫組切割，繼而分别留下一個不同的重組位點。 ORF方船村向(xiàng)的反轉，使得第二個OR可以在啓動子的驅愛站動下正常表達，而第一個ORF將(jiāng)不表達。 由于ORF房雜側翼是兩(liǎng)個不同的Lox-變體位點高笑，所以即使存在Cre也不會(huì)進(照花jìn)一步發(fā)生重組。
腺病毒載體首先是以質粒的方式構建并使用E.森藍 coli擴增，然後(hòu)線性化後(hòu畫老)轉染進(jìn)入包裝細胞。在包裝過(guò)程中，位于兩靜大(liǎng)個反向(xiàng)重複序列呢高（ITR）之間的DNA片段與由包裝細胞表達的病毒線關蛋白進(jìn)一步包裝成(chéng)病毒顆粒。睡頻對(duì)于上述的FLEX介導的Cre-Swit生妹ch條件性表達腺病毒載體，FLEX 醫我Cre-Switch開(kāi)關位于兩(liǎng)個ITR地畫之間。當病毒轉導宿主細胞時(shí)，載體并以遊離DN房山A的形式存在于細胞核中。
通過(guò)改造優化，我們的腺靜金病毒載體缺失了E1A、E1B和E3區，前兩(liǎng)對又者與病毒包裝相關（這(zhè)愛讀兩(liǎng)個基因已被(bèi)整合到包通樂裝細胞的基因組中）。因此，運用我們的病毒載體包裝出來的病毒是複制缺老錯陷型的（隻能(néng)轉導靶細胞而不能(néng)弟麗自我複制），大大提高了生物安全性。
關于該載體系統的更多信息，請參考以下文獻。
| 參考文獻 | 主題 |
|---|---|
| Proc Natl Acad Sci U S 城醫A. 91:8802 (1994) | The 2nd generation aden會房ovirus vectors |
| J Gen Virol. 36:59飛秒 (1977) | A packaging cell line for煙很 adenovirus vectors |
| J Virol. 79:5437 (2005) | Replication-competent a她頻denovirus (RCA) formation in 照我293 Cells |
| Gene Ther. 3:75 (1996) | A cell line for testing RCA |
| Gene. 216:55 (1998) | Characterization of LoxP 對從mutants, including Lox2272妹就 |
| Nat Biotechnol. 21:562 (2體化003) | Development of the FLEX switc海睡h system |
| J Neurosci. 28:7025 (2008) | Application of a FL年在EX switch system |
亮點
FLEX Cre-Switch條件性表達腺病毒載體專爲在哺乳動物細湖校胞中實現兩(liǎng)個ORF可切換的基因表達而設計。目的這亮基因表達受到用戶自定義的啓動子調節，并在Cre在聽重組酶共表達的情況下沉默一個目的基因，并激活另一個目的基因表達。老懂
該載體由血清型5（Ad5）腺病毒衍生而來。經(jīng)優化，該場上載體系統在大腸杆菌體内具有很高的線師拷貝數，包裝的活病毒具有很高的滴度，對(duì)大多數宿主細胞具有高效的轉導能舞坐(néng)力，能(néng)有效地把載體整合到靶細胞基因組并實現外源基子玩因的高水平表達。
優勢
基因激活失活可控：兩(liǎng)個ORF的方向(xiàng可地)彼此相反确保當表達正向(xiàng)方向(xiàng)的ORF時(年亮shí)，反向(xiàng)的ORF被(bèi)抑制，爸化可防止基因發(fā)生洩漏表達。
對(duì)宿主基因組造成(chéng)破壞商不的低風險性：在轉導進(jìn)入靶細胞後(hòu)，腺病毒作子載體在細胞核保持著(zhe)遊離DNA的狀态，可以降低宿主基因組被(b花著èi)破壞而緻癌的風險，使其成(chéng)爲人歌大類體内實驗的理想載體。
超高病毒滴度：腺病毒可通過(guò)再次轉導包裝快雪細胞而得到大量擴增，從而獲得超高滴度病毒，慢病毒載體、逆轉錄病毒載體和AA話窗V載體都(dōu)不具有這(zhè)個特性南冷。我們提供的腺病毒滴度可以達到&你如gt;1012 VP/ml。
載體容量非常大：腺病毒能(néng)有效包裝的基因組上限大小是~38.7 kb（從5' ITR家日到3' ITR）。在除去腺病毒包裝表達所需主要元件所占用的容量之後(hòu)報資，我們的載體具有約~7.5 kb的裝載空間以容納目的DNA（例如啓動子，OR家動F和熒光标記）。相比起(qǐ)容量爲6.4 kb的慢病毒表達載體，腺病毒載體容女靜量更大，能(néng)滿絕大多數應用要求。
宿主範圍廣泛：來源于人、小鼠和大鼠等常用哺乳動物細胞都(dōu)能畫錯(néng)被(bèi)腺病毒載體轉導，但某些細胞類型則比較難轉什廠導（見下文不足之處）。
體内外實驗均有效：我們的載體不僅能(néng)用花自于體内活體動物實驗，還(hái)具有體外細胞轉導能(néng)力。
安全性高：爲了确保腺病毒載體的生物安全性，我們的腺病電空毒載體缺失了病毒包裝所必須的基因（計區這(zhè)些基因被(bèi)整合到包裝細胞的基因組）。 所以，利用我們人用的腺病毒載體包裝出來的病毒是複制缺陷型的，并且隻有在包紙影裝細胞中才具有複制能(néng)家男力。
不足之處
載體DNA非整合型：腺病毒基因組不會(huì)整合到靶細胞的基因組中，而是以遊離筆北DNA的形式存在，并且随著(zhe)時(shí)間推移逐漸還南丢失，特别是在分裂細胞中。
難以轉導特定類型的細胞：雖然我們的腺病毒載體可以轉導很多類型的細胞包括到弟非分裂細胞，但對(duì)某些特定類型的細胞如内皮細胞、平滑肌火大細胞、呼吸上皮分化細胞、外周血細近計胞、神經(jīng)元和造血幹細胞等，卻無法進(jìn)行有效的轉導。舞道
較強的免疫原性：活腺病毒會(huì)在動物體内引起(qǐ間校)強烈的免疫反應，從而限制了其在體内的某些應用。線弟
技術複雜：使用腺病毒載體時(shí)，需要在包裝細胞中通兒産生活病毒，然後(hòu)測定病她我毒滴度。這(zhè)些過(guò)程技術難度更高船日，周期更長(cháng)。
載體關鍵元件
5' ITR: 5' inverted terminal repeat. In wild 吃月type virus, 5' ITR and 3' ITR are esse媽朋ntially identical in sequence. They業志 reside on two ends of th爸技e viral genome pointing in opposite飛話 directions, where they s討公erve as the origin o綠可f viral genome replication.
Ψ: Adenovirus packa章房ging signal required for拍門 the packaging of 務資viral DNA into virus.
Promoter: The promoter dr對醫iving your gene of interest is pl街錯aced here.
Lox2272: Recombination site for Cre r道跳ecombinase. Mutate我南d Lox site with two base sub筆就stitutions of wild type LoxP. 錢理Incompatible with LoxP site物那s. When Cre is 低花present, the LoxP視看 and LoxP2272 sites will be cut and r謝不ecombine with compatible sites.
LoxP: Recombination site for Cre re電通combinase. Incompatible with 影算Lox2272 sites. Whe得音n Cre is present, the LoxP a光從nd Lox2272 sites will be cut 低答and recombine with compatibl秒快e sites.
Kozak: Kozak consensus sequence. It i公書s placed in front動車 of the start codon of the ORF of i這友nterest because it is believed畫水 to facilitate tra林技nslation initiation in eukaryot機照es.
ORF #1: The open reading fr開有ame of a gene of interest is placed he玩場re, in a sense ori相頻entation. This g上離ene can be expressed wit東雜hout Cre-mediat門新ed recombination.
ORF #2: The open reading fra在公me of a gene of interest is短器 placed here, in an antisense orie資校ntation. This gene c東拍an only be expres呢火sed after Cre-mediated recombination.
TK pA: Herpes simplex virus thym對刀idine kinase polyadenylation signal劇科. It facilitate我議s transcriptional termination of the up體內stream ORF.
ΔAd5: Portion of Ad5 genome書術 between the two ITRs minus the事都 E1A, E1B and E3 regions.
3' ITR: 3' inverted terminal repeat.
pBR322 ori: pBR322 origin of 作小replication. Plasmid吃男s carrying this origin exist in mediu學雨m copy numbers in E. col銀是i.
Ampicillin: Ampicillin resistance gene. It農和 allows the plasmid t畫能o be maintained by ampicil路綠lin selection in 視友E. coli.
PacI: PacI restriction site (一著PacI is a rare cutter 做花that cuts at TTAATTAA). The two 科熱PacI restriction sites on the vecto算靜r can be used to議身 linearize the vector 鐘雪and remove the vector backbo北高ne from the viral sequence, which is 友師necessary for efficient 市花packaging.
哺乳動物基因FLEX條件性表達腺病毒載體（Cre-S用東witch）
概述
FLEX條件性表達腺病毒載體結合多草了載體家的高效的腺病毒載體系統和Cre響應的房書FLEX條件性基因表達載體，可以幫間物助您實現在多種(zhǒng)多樣答吃(yàng)的哺乳動物細胞中以腺森術病毒轉導Cre響應的FLEX基因表達調為這控開(kāi)關。FLEX Cre-S了公witch系統的兩(liǎng票鐘)個Lox-變體重組位點之間包含一對(duì)反向(xiàng)但近平行的ORF，在Cre重組酶的一厭調控下ORF上的兩(liǎng)個目的基因編兵南碼方向(xiàng)反轉，從而讓一個目的基因從激活表達變成(chéng)沉子討默，另一個目的基因從沉默變成(chéng)激活表達白相。
FLEX Cre-switch系統由兩(liǎng她麗)對(duì)異型Lox-變體重組位點組成(chéng)，其中野生型序列校器稱爲LoxP，突變體稱爲Lox2272，分别位不什于兩(liǎng)個基因ORF的兩(liǎng)相這側。 兩(liǎng)個ORF相互反向(xiàng)，其中一個舞兵ORF具有正确的讀碼方向(xi商船àng)（相對(duì)于啓動子）。兩(liǎng)種(zh從會ǒng)Lox-變體都(dōu)可慢在被(bèi)Cre識别，但隻有相同的Lox位點對(duì)可以彼此車朋重組，與其他Lox-變體不能(néng少志)進(jìn)行重組。LoxP和Lox2272位點以交替方式位于兩通懂(liǎng)個ORF兩(liǎng)端，每對(雪內duì)位點互爲反向(xiàng)。Cre重組酶不存樂對在的情況時(shí)，第一個ORF由于其編離計碼方向(xiàng)與啓動子方向(xiàng)相同，可以在客海唱戶定制的啓動子驅動下正常表達，而第二個OR體我F由于其方向(xiàng)相反則無法正常表達。在Cre的存在下，LoxP和L愛答ox2272位點對(duì)分别重組，導緻兩(liǎn市通g)個ORF方向(xiàng)反轉，說關且其中的一對(duì)重組位點將(jiāng)具有相同友問的方向(xiàng)，Cre會(huì)介導産生正向(xiàng)重組切割，繼煙離而分别留下一個不同的重組位點。 ORF方向(x就窗iàng)的反轉，使得第二個OR可以在啓她在動子的驅動下正常表達，而第一個ORF將(jiāng)不綠服表達。 由于ORF側翼是兩(liǎ師是ng)個不同的Lox-變體位點內個，所以即使存在Cre也不會(huì)拿金進(jìn)一步發(fā)生重組。
腺病毒載體首先是以質粒的方式構建并使用E少議. coli擴增，然後(hòu)線性化後(村裡hòu)轉染進(jìn)入包裝細胞。在包裝都話過(guò)程中，位于兩(liǎng)個反向(xiàng)重複序列（ITR）之腦冷間的DNA片段與由包裝細胞表達的病毒蛋白進去有(jìn)一步包裝成(chéng)病毒顆粒。影子對(duì)于上述的FLEX介導爸雪的Cre-Switch條件性表達腺病毒載體，FLEX拍用 Cre-Switch開(kāi)關位于兩(li暗吃ǎng)個ITR之間。當病毒轉導宿讀吧主細胞時(shí)，載體并以遊離DNA的形式存空來在于細胞核中。
通過(guò)改造優化，我們的腺病毒載體缺失了E1A、E1B和E3區，前兩(校相liǎng)者與病毒包裝相關（這(zhè)兩(l作開iǎng)個基因已被(bèi)整物個合到包裝細胞的基因組中）。因此，運用我們的病毒載體包裝出說秒來的病毒是複制缺陷型的（隻能(né窗答ng)轉導靶細胞而不能(néng)自我件用複制），大大提高了生物安全性。
關于該載體系統的更多信息，請參考以下文獻。
| 參考文獻 | 主題 |
|---|---|
| Proc Natl Acad Sci U S A. 91:8802 (199子低4) | The 2nd generation adenovirus v一做ectors |
| J Gen Virol. 36:59 (1977) | A packaging cell line for adenovirus白呢 vectors |
| J Virol. 79:5437 (2005) | Replication-compe好作tent adenovirus (RCA) for船吃mation in 293 Cells |
| Gene Ther. 3:75 (1996) | A cell line for testing RCA |
| Gene. 216:55 (1998) | Characterization of LoxP mutants, inc坐小luding Lox2272 |
| Nat Biotechnol. 21:562 舞厭(2003) | Development of the FLEX switch sy業為stem |
| J Neurosci. 28:7025 (2008) | Application of a 吧從FLEX switch system |
亮點
FLEX Cre-Switch條件性表達腺病毒載體專爲在哺乳動物細胞中實現兩朋慢(liǎng)個ORF可切換的基因表達而設計。目的基因表達受頻愛到用戶自定義的啓動子調節，并在Cr錯有e重組酶共表達的情況下沉默一個黑有目的基因，并激活另一個目的基因表達。志習
該載體由血清型5（Ad5）腺病毒衍生而來。經(jīng)優化，該載體系統在大腸中舊杆菌體内具有很高的拷貝數，包裝的活病毒具有很高的滴度，對(duì)大多數宿主是森細胞具有高效的轉導能(néng)力，能(néng湖志)有效地把載體整合到靶細胞基因組并實現外源基因的高水平表達。
優勢
基因激活失活可控：兩(liǎng)個ORF的方向(xiàng)彼此相反确保當表達正向(xià文從ng)方向(xiàng)的ORF時(shí)，反向坐話(xiàng)的ORF被(bèi)抑制，可防止基因發(fā筆是)生洩漏表達。
對(duì)宿主基因組造成(chéng)破理小壞的低風險性：在轉導進(jìn)入靶細胞後(hòu)，腺病毒載體一影在細胞核保持著(zhe)遊離DNA的狀态近子，可以降低宿主基因組被(bèi)破壞而緻不那癌的風險，使其成(chéng)爲視白人類體内實驗的理想載體。
超高病毒滴度：腺病毒可通過(guò)再次轉導包裝細胞而得到大量擴增，從紅那而獲得超高滴度病毒，慢病毒載體、逆轉錄病毒載體和AAV載體都(dōu)不具遠是有這(zhè)個特性。我們提供的腺病毒滴街謝度可以達到>1012 VP/ml。
載體容量非常大：腺病毒能(néng)有效包裝的基的街因組上限大小是~38.7 kb（從5' ITR到3' ITR）。在除章和去腺病毒包裝表達所需主要元件所占用的容量之後(hòu)，我們的載體具爸為有約~7.5 kb的裝載空間以容納目的DNA（例如啓動子，O多遠RF和熒光标記）。相比起(qǐ)容量爲6.4 請吃kb的慢病毒表達載體，腺病毒載體容量更大，能(néng)滿絕大多數應弟月用要求。
宿主範圍廣泛：來源于人、小鼠和大鼠等常用哺乳動物細胞都(dōu)能(néng)被(bèi)票看腺病毒載體轉導，但某些細胞類型則比較難轉導（見下文不足之處）。
體内外實驗均有效：我們的載體不僅能(néng)用于體内活體動物實驗，還動事(hái)具有體外細胞轉導能(néng)力。
安全性高：爲了确保腺病毒載體的生物安全性，我們的腺病毒載體缺失了腦我病毒包裝所必須的基因（這(zhè)些基因被(bèi)整厭月合到包裝細胞的基因組）。 所以，利用我們的腺病毒載體包裝出來的病毒是複聽聽制缺陷型的，并且隻有在包裝細胞中才具有複制員家能(néng)力。
不足之處
載體DNA非整合型：腺病毒基因組不會(huì)整合到靶細胞的基因組中，而是以遊離DNA的形國從式存在，并且随著(zhe)時(shí)間推到算移逐漸丢失，特别是在分裂細胞中。
難以轉導特定類型的細胞：雖然我們的腺病毒載體可以轉導很多類型的細胞包括非分裂細胞，來劇但對(duì)某些特定類型的細胞如内皮細胞費山、平滑肌細胞、呼吸上皮分化細胞、外周血細胞、神經(jīng道錢)元和造血幹細胞等，卻無法進(jìn)行有他遠效的轉導。
較強的免疫原性：活腺病毒會(huì)在動物體内引起(qǐ)強烈的免疫反應，從而限制了其在土都體内的某些應用。
技術複雜：使用腺病毒載體時(shí)，需要在包裝細胞中産生活病毒，然後(hòu)個很測定病毒滴度。這(zhè)些過(guò)程行拿技術難度更高，周期更長(cháng)。裡花
載體關鍵元件
5' ITR: 5' inverted terminal repeat. In wild靜暗 type virus, 5' ITR and 3' ITR are見得 essentially identical in se多資quence. They reside on two ends of th火視e viral genome pointing in oppo錢不site directions算廠, where they serve as the origin of v近區iral genome replication.
Ψ: Adenovirus packaging signal requ錯都ired for the packaging 女還of viral DNA into virus.
Promoter: The promoter driving your gene of in草書terest is placed here.
Lox2272: Recombination sit理行e for Cre recombinase. Mutated Lox sit海自e with two base substitutions of wild會友 type LoxP. Incompatible 長放with LoxP sites. Whe你低n Cre is present, the LoxP and服聽 LoxP2272 sites will be cut and地答 recombine with compa電房tible sites.
LoxP: Recombinat山站ion site for Cre recombinase. Incom山說patible with Lo討車x2272 sites. When Cre is present,工兵 the LoxP and Lox2272 sites will be c人章ut and recombin空腦e with compatible sites.
Kozak: Kozak consensus seque跳還nce. It is placed i站家n front of the start codon of th民海e ORF of interest because it is bel黃視ieved to facilitate trans計城lation initiation in eukary開鐵otes.
ORF #1: The open reading frame of a 答妹gene of interest i短多s placed here, in a sens文費e orientation. This gene can be expre見少ssed without Cre作房-mediated recombination.
ORF #2: The open reading frame of a ge喝湖ne of interest is placed here,美綠 in an antisense o志錢rientation. This gene can on鄉能ly be expressed after Cre-med日說iated recombination.
TK pA: Herpes simplex virus thymidine ki樹關nase polyadenylation signal. I市舞t facilitates transcri請會ptional termination of the upstream 也司ORF.
ΔAd5: Portion of Ad5 genome between 煙店the two ITRs minus the E1A, E1B a媽說nd E3 regions.
3' ITR: 3' inverted termin森遠al repeat.
pBR322 ori: pBR322 origin of re個問plication. Plasmids carryi視城ng this origin 微南exist in medium子秒 copy numbers in E. coli.
Ampicillin: Ampicillin res多間istance gene. It allows the plasmid to 紅音be maintained by a書司mpicillin selection in E. coli.
PacI: PacI restriction site (PacI is a r音窗are cutter that cuts at TTA兵師ATTAA). The two PacI restric場不tion sites on the靜朋 vector can be used to li哥身nearize the vector and一什 remove the vector都物 backbone from 地刀the viral sequence, which會熱 is necessary for effici通音ent packaging.