哺乳動物CAR表達質粒載體

概述

利用嵌合抗原受體 (Chimeric antigen receptor河們，CAR) 載體生産可識别腫瘤相關抗原的工程T細胞（也稱爲CAR-T有你細胞）已成(chéng)爲一種(zhǒng)極富前景的癌症治療工具但生。在 CAR-T細胞免疫療法中，來自患者（自時樹體）或健康供體（同種(zhǒng)小刀異體）的T細胞經(jīng)過(guò)改造表達CAR。中子CAR受體可以靶向(xiàng師知)識别腫瘤細胞表面(miàn)抗原，活化T細胞使國她其發(fā)揮免疫作用以幫助殺傷腫瘤細胞。

CAR受體的結構由四個主要部分組成(c說老héng)：（1）一個胞外抗原識别結亮空構域，由已知特異性的抗體的單鏈可開時變區片段 (Single chain variable fragme計相nt，scFv) 組成(chéng)。 scFv白鄉促進(jìn)抗原結合，包含一個輕鏈可變區片段和一個特異的單克隆抗體的重鏈片信錯段，兩(liǎng)者通過(guò拍高)一個柔性的肽鏈相連；（2）一個位于胞外的鉸鏈區或白到間隔區，將(jiāng)scFv與CAR喝離的跨膜結構域連接起(qǐ)來，并爲CAR的結構提供靈活性和穩定性；（章鐵3）跨膜結構域，將(jiāng)CAR錨定在質膜上報線，從而將(jiāng)胞外的鉸鏈區和抗原結合結構域同細胞内結構域關聯起大也(qǐ)來。它在增強受體表達和穩定性工費方面(miàn)起(qǐ)著(zhe)關鍵作用；（4）胞内信号域他化，通常源自T細胞受體的CD3 zeta鏈并包含免疫受體酪氨酸激活基錢現序（Immunoreceptor tyrosi近志ne-based activation motif，ITAM)。抗原結區低合CAR後(hòu)，ITAM被(bèi)磷酸化并激件懂活下遊信号傳導，從而導緻T細胞的後(h關術òu)續活化。此外，該胞内結構域還(hái)可以引入一個或多個與刀飛CD3 zeta信号域串聯的共外林刺激域（來源于CD28、CD13術話7等），以改善T細胞增殖效率和活化的持久性。

CAR的結構在過(guò)去幾年中随著(zhe)對(duì站長)胞内結構域的修改而不斷發(fā)展。第一代CAR僅包含一個衍生于C山又D3 zeta鏈的信号域。雖然這(zhè)種(zh也月ǒng)CAR可以激活T細胞，但是由于表達此類CAR的T細胞的細路技胞毒性和增殖能(néng)力偏低，它們在體内的抗腫瘤活性并不理想。第二代C雨慢AR除了包含一個CD3 zeta信号域，還(hái)具有一個胞内的共刺激域，因金熱此表達第二代CAR的T細胞顯著改善了其體内增殖能(néng)力、擴增能(nén司市g)力和活化的持久性。爲了進(jìn)一步優化 CAR T細一風胞的抗腫瘤功效，第三代CAR除了CD3 zeta外，的暗還(hái)引入了兩(liǎng)個胞内順式作用的共刺激結構域中煙。此後(hòu)，通過(guò)修飾胞内結構域以進(jìn)行員民誘導表達或組成(chéng)型表達細胞因子，第站兵四代CAR從第二代CAR開(kāi)發(fā)獲得。第五代和最新一就呢代CAR也是從第二代CAR衍生而來，整合了細胞因為化子受體的胞内結構域。

我們的CAR表達質粒載體非常适合哥子非病毒的第二代CAR表達盒轉染湖拿T細胞。整個CAR 表達盒包括scFv區、鉸大件鏈區、跨膜結構域和胞内CD3 zeta信号域以及商就共刺激域，均位于用戶選擇的啓動子下遊。用常規質粒載體轉染的一個關鍵優勢是它是城為瞬時(shí)轉染的，隻有非常少的質粒會(hu們有ì)穩定整合到細胞基因組中（通常小于1%）。

有關此載體系統的更多信息，請參閱以窗中下文獻。

參考文獻	主題
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亮點

我們的CAR表達質粒載體适用于第二代CAR的瞬時(shí)表達，并且經(我地jīng)過(guò)特殊優化，在大腸杆菌種(zhǒng)具有多了很高的拷貝數。通過(guò)質粒上的自定義标記基家制因用戶可以方便地觀測轉染效果。

優勢

技術簡單：對(duì)比病毒轉導，CAR表達質粒載體通過(guò)電轉染法轉染T細胞嗎還是一種(zhǒng)較爲簡單的技術。病毒載體的病毒包裝過(guò北書)程耗時(shí)且技術上具有相當挑戰性。

安全性：CAR表達質粒載體轉染至細胞後(hòu)爲瞬時子技(shí)表達，不整合細胞基因組，因此對(duì)比逆轉錄日冷病毒類的載體不會(huì)産生顯著的插入技時突變風險。

大裝載量：我們的載體大小可達30 kb，而載體骨架隻占有3 kb，因此留有相當湖湖多的空間用于CAR表達盒的設計，比如務區加入啓動子、标記基因以及額外的目的基因等。

低成(chéng)本：生産臨床級别的質粒載體比病毒載體可以減少相當多的成(chéng)本，使用CA物那R表達質粒載體制備用于臨床研究老服的CAR T細胞具有很高的性價比。由于CAR T細胞的臨床效服山果根據臨床前的小鼠上的實驗效果進(jìn)行行還預測，因此在臨床研究中也需要使用CAR T細胞進(高唱jìn)行研究。

不足之處

遞送方式：CAR表達質粒載體通過(guò)電轉染法轉染舞我T細胞隻能(néng)對(duì)低至中等數量機算的細胞成(chéng)功遞送CAR表達盒。此外，電轉染法對(duì)高為T細胞有潛在的毒性，可能(néng)信少會(huì)減少具有功能(néng)的CAR T細胞的跳匠産量。因此有可能(néng)需要在體外延長(cháng)細胞的培養時(sh空分í)間以達到灌注的細胞數量要求，而過(guò)長(cháng)時(shí子月)間的培養也會(huì)導緻細胞表型的改變與T細胞長(cháng)期個個記憶功能(néng)的減弱。

載體DNA非整合性：質粒載體轉染至細胞後(hòu)主要以遊秒秒離體形式的DNA存在，隻有很低的頻率（10²~10⁶分之一，取決于細胞類型）會(huì)整合基因組。如果載體上帶有一章藥篩标記或者熒光标記，基因組整合型的載裡綠體有利于長(cháng)周期細胞培養後物服(hòu)的細胞篩選。

載體關鍵元件

Promoter: The promoter dr個的iving your CAR ex們些pression cassette 謝兒is placed here.

Kozak: Kozak consensus sequence. 你妹It is placed in front 銀文of the start codon of 外視the ORF of interest because在動 it is believed to樂河 facilitate tra微技nslation initiation in eukaryotes.鐵文

CD8-leader: Leader signal pept房藍ide of T-cell surface 區暗glycoprotein CD8 alpha chain. Direc就腦ts transport and localizat些金ion of the protein to the T-ce化知ll surface.

scFv: Single chain variable fragment derived 秒玩from a monoclonal 影吃antibody of known specificity. Recogni紅木zes cells in an antigen-specific m厭低anner.

Hinge: Extracellular hinge物新 region of the CAR. Co黃化nnects scFv with the transmembrane 多鐵region providing stability花資 and flexibilty for efficient 件民CAR expression and function; enhances e子吧fficiency of tu看費mor recognition; improves expansio爸音n of CAR-T cells得件.

Transmembrane domain: Transmembrane domain金還 of the CAR. Anchors the CAR to the pla頻暗sma membrane and bridges 器日the extracellular hinge妹文 as well as antige習高n recognition domains wit遠樹h the intracellular s現門ignaling region; enhances receptor雪動 expression and stability.

Costimulatory domain區舞: Intracellular costimu費紙latory domain of the答在 CAR. Improves overall survival, pr不知oliferation, and pe間員rsistence of activated CAR-T科靜 cells.

CD3zeta: Intracellular domain of the T c綠校ell receptor-CD3ζ chain. Acts as廠林 a stimulatory molecule 什森for activating T cell-medi腦但ated immune respo現裡nse.

SV40 late pA: Simian virus 40 la慢呢te polyadenylat物要ion signal. It facilitates transcriptio能志nal termination of 藍銀the upstream CAR expression cassette.

CMV promoter: 妹事;Human cytomegalovirus immedi低紙ate early promoter. It d他為rives the ubiquitous expression讀秒 of the downstream marker gene書照.

Marker: A drug selection 村雪gene (such as neomycin res有子istance), a visually de頻森tectable gene (such 現答as EGFP), or a dual-repo高問rter gene (such as EGFP/N她草eo). This allows cells trans裡匠duced with the vector to be sele議自cted and/or visualized.

BGH pA: Bovine growth hormone polyadenylati校湖on. It facilitates transcri劇人ptional terminati西拿on of the upstream O費見RF.

Ampicillin: Ampicillin resistan影內ce gene. It allows the plasmid to b要森e maintained by ampicillin selection懂樂 in E. coli.

pUC ori: pUC origin of replicatio秒身n. Plasmids carrying t如歌his origin exist i靜多n high copy numbers醫花 in E. coli.

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