哺乳動物shRNA幹擾AAV載體

概述

我們的腺相關病毒（adeno-associated virus為海，簡稱AAV）shRNA幹擾載體系統是一種(zhǒng書亮)非常高效的能(néng)穩定在體内和體外幹擾各種(zhǒn民北g)哺乳動物細胞靶基因表達的載體工冷見具。AAV的免疫原性極低，在體内幾乎腦木沒(méi)有緻病性，使得AAV成(chéng)爲許多動房嗎物研究的理想工具。

AAV重組載體構建完成(chéng)後(hòu)與輔助質粒一起(朋影qǐ)轉染進(jìn)入包裝細胞。在短他包裝細胞中，位于兩(liǎng)個反向(xiàng)重月我複序列（ITRs）之間的DNA片段與輔助質粒表達秒吃的病毒蛋白進(jìn)一步包裝成(chéng)病毒顆粒。當病毒轉道木導宿主細胞時(shí)，兩(liǎng我玩)個ITR之間的外源DNA及病毒基因組一起(q費關ǐ)進(jìn)入細胞，線性雙鏈DNA基那的因組以遊離DNA的形式存在于細胞核中。由人類U6啓動子驅拿分動表達的shRNA將(jiāng)會(huì)導緻靶火著基因mRNA的降解。

在大多數情況下，可以在生物安全1級（BSL1）設道音施中處理AAV。AAV是複制缺亮嗎陷型的、不會(huì)引起(qǐ)炎答線症反應和引發(fā)人類疾病。

人們已從自然界中鑒定出許多AAV病毒株，根據病毒表面商也(miàn)衣殼蛋白的不同抗原將(jiāng)它們分也但成(chéng)不同的血清型。不同血清型的病毒具有不同的組織親和性（開算即感染組織特異性）。當我們的AAV載體使用鐵男不同的衣殼蛋白包裝病毒時(shí)，則會(huì)賦予病毒不同的血來男清型。AAV包裝時(shí)的ITR序列來源于AAV2，這(zhè)是一種(舞快zhǒng)常用的AAV載體構建方式，不影響血木照清型。另一方面(miàn)，決定血清型的衣殼蛋白校日基因由Rep/Cap包裝質粒編碼。下紙輛表列出了不同的AAV血清型及對(duì)應的組織親和性。

血清型	組織親和性
AAV1	SM, CNS, lung, retina, 音吧pancreas, heart, liver對視
AAV2	SM, CNS, liver, kidney, 藍資retina
AAV3	SM
AAV4	CNS, retina, lung, kidney
AAV5	SM, CNS, lung, retina
AAV6	SM, heart, lung, adipose, live討們r
AAV7	SM, retina, CNS, liver
AAV8	SM, CNS, retina, li和術ver, pancreas, he書錯art, kidney, adipose
AAV9	SM, lung, liver, h船時eart, pancreas, CNS, retina, test算姐es, kidney
AAV-rh10	SM, lung, liver, hea好內rt, pancreas, CNS, r自森etina, kidney

關于該載體系統的更多信息，請參考以下文獻地中。

參考文獻	主題
Methods in Enzy. 507:229-54 (2高熱012)	Review of AAV virolo舊可gy and uses
Curr Opin Pharmacol. 2問用4:59-67 (2015)	AAV use in gene therapy, and ser件喝otype differences

亮點

我們的AAV載體是經(jīng)過(gu的自ò)優化的，可在大腸杆菌中進(jìn)行高拷貝複制，跳飛是一個包裝病毒滴度高，細胞轉導效率高，轉慢章基因高水平表達的載體系統。該載體可用所有已知衣殼蛋白血清型的輔助質粒坐用進(jìn)行包裝，包裝出來的病毒具有非算離常高的轉導效率，且具有極高的生物安全性。

優勢

安全性：AAV是可供選擇的最安全的病毒載體，場們它是複制缺陷的，不會(huì)引起子吧(qǐ)任何人類疾病。

對(duì)宿主基因組造成(chéng)破壞的風險性低：病毒轉導到宿主細胞後(hòu)，AAV載體以遊離DNA市遠的形式存在于細胞核中。AAV對(duì)宿主黑爸基因組的非整合特性使其減少了對(duì)宿主基因組的破壞而緻癌的年房風險，可作爲人類體内應用的理想載體。

穩定幹擾：AAV通常在核内保持穩定的遊離狀态，由U6啓動子驅動shRNA的組成(c算報héng)型表達，對(duì)靶基因的機業幹擾通常是穩定且持久的。

病毒滴度高：利用我們的AAV病毒載體可以包裝成(chéng)高滴度的病毒。我們提供的病毒包長車裝服務病毒滴度可達到>10¹³ GC/ml。

宿主範圍廣：針對(duì)不同來源的常用哺乳動物（如人、小鼠和大鼠）細胞了但和組織，將(jiāng)我們的AA店資V載體包裝成(chéng)對(duì)其具有親和性的血清型，可輕易是說實現高效轉導。但是，某些類型的細胞仍然難以轉導（見下文不足之處），這(z票海hè)與所用的血清型有關。

體内外實驗均有效：我們的載體不僅能(néng)用于體内活體動物實驗，還男還(hái)具有體外細胞轉導能(né紙拿ng)力。

不足之處

難以轉導特定類型的細胞：當利用合适的血清型進(jìn)行包裝時(shí)，我們的AAV載體系統廠信可以轉導很多不同類型的細胞，包括非分裂細胞。不同個的AAV血清型對(duì)不同類型的細胞具有不同的嗜性，針房他對(duì)某種(zhǒng)特定類型的細胞需要特定血清型。

穩定幹擾：AAV通常在核内保持穩定的遊離狀态，由U6啓動子有輛驅動shRNA的組成(chéng)型表達。一旦AAV shRNA老鐵幹擾載體對(duì)基因産生了幹擾，不街目的基因的表達就(jiù)很難被(bèi)重我上新激活。根據不同的實驗目的，這(zhè)有可能(néng)是優勢也老嗎可能(néng)是劣勢。

技術複雜：使用AAV病毒載體時(shí)，需要在包裝細胞中産河動生活病毒，然後(hòu)測定病毒滴度。這(zhè)些過(guò)程相對(d拍費uì)于常規質粒轉染，技術難度更煙機高，周期更長(cháng)。在訂購載體的同時(shí)，可以通場能過(guò)訂購我們的病毒包裝服務輕松解決這(zhè)些問題。

載體關鍵元件

5' ITR: 5' inverted terminal repeat. In wi能劇ld type virus, 5' ITR a校工nd 3' ITR are essentially id國身entical in sequence. 木內They reside on two ends of th理如e viral genome pointing in opposit我麗e directions, whe人理re they serve as 計吃the origin of viral ge腦路nome replication.

U6 Promoter: Drives expression o那到f the shRNA. This is 友來the promoter of the hu不下man U6 snRNA gene間地, an RNA polymerase III promoter which 內街efficiently expresses short RNAs.

Sense, Antisense: These sequences are derived樂聽 from your target sequences, and are畫但 transcribed to form the stem p靜理ortion of the “hairpin” structu個火re of the shRNA花西.

Loop: This optimized seque光快nce is transcribed t能兵o form the loop p房子ortion of the shRNA “hairp錢妹in” structure.

Terminator: Terminates tran吧場scription of the shRNA.

CMV promoter: Human cytomegalovirus im工你mediate early promoter. It dr務快ives the ubiquitous expressi吃們on of the downstream 些森marker gene.

Marker: A drug selection gene (such as neomy玩道cin resistance), a visu影子ally detectable gene (such as 謝中EGFP), or a dual-reporter gene (拍習such as EGFP/Neo)北子. This allows cells transduced wi話雜th the vector to be selected and/玩愛or visualized.

SV40 late pA: Simian virus 40 lat生看e polyadenylation signal. It facilitat鐘冷es transcriptional terminati對著on of the upstream ORF.

3' ITR: 3' inverted terminal repeat. See 身一description for 5’ ITR.

Ampicillin: Ampicillin resistance gene. It allows t樹頻he plasmid to be maintained by am工業picillin select男麗ion in E. coli.

pUC ori: pUC origin of replication. Pl友家asmids carrying thi為民s origin exist in high copy 花北numbers in E. coli.

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