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mRNA基因遞送解決方案
CRISPR基因編輯解決方案
shRNA基因敲低解決方案 慢綠;
哺乳動物基因FLEX條件性表達慢病毒載子你體（Cre-Off）
概述
FLEX條件性表達慢病毒載體結合了載體家的高效的第三代慢病毒載體系統和C空很re響應的FLEX條件性基因表達載體，幫助票了您實現在病毒宿主基因組上永久整合Cre重組酶響應的FLEX Cre-Off基冷討因調控開(kāi)關。FLEX Cre-Off系做國統利用位于目的基因兩(liǎn服文g)側的Lox-變體重組位點，在Cre重組酶的調控下目的基因發(fā答刀)生反轉，目的基因不表達；而Cre不存在的情土技況下，目的基因正常表達。
FLEX Cre-Off系統由兩(liǎng)對(duì)異劇她型Lox-變體重組位點組成(chéng)，靜金其中野生型序列稱爲LoxP，突離妹變體稱爲Lox2272，分别位于ORF的兩(liǎng)側。舊西 兩(liǎng)種(zhǒng)Lox-變體都(dōu)可風樹被(bèi)Cre識别，但隻有相同的Lox位點對(duì林厭)可以彼此重組，與其他Lox-變體不能(也好néng)進(jìn)行重組。 LoxP和Lox2272位錢嗎點以交替方式位于ORF兩(liǎn河跳g)端，每對(duì)位點互爲問影反向(xiàng)。Cre重組酶不存在弟小的情況下，客戶定制的啓動子可以驅動目的基因的正常表達。Cre重暗又組酶存在的情況下，LoxP和Lox2272位點對(duì)分别重組，導緻ORF新車方向(xiàng)反轉爲反向(xiàng)，亮紅且其中的一對(duì)重組位點將(jiāng)具有相同的方向(xiàn少銀g)，Cre會(huì)介導産生正向(xiàng)重組切割，繼而分别留行拍下一個不同的重組位點。ORF方向(xiàng)的反時書轉，使得目的基因無法正常表達。由于O志慢RF側翼是兩(liǎng)個不同的Lox-變體位點，子校所以即使存在Cre也不會(huì)進(jìn)一步發(fā)生重組。厭大
慢病毒載體首先以質粒的方式構建并使用E. co白睡li擴增，然後(hòu)與多個輔助質粒一同轉染至包農關裝細胞。載體上的兩(liǎng唱分)個LTR區域之間的DNA序列將(jiā離生ng)被(bèi)轉錄成(chéng)R車了NA，而輔助質粒表達的病毒蛋白國知進(jìn)一步與這(zhè)些RNA組裝形成(c她麗héng)完整的病毒顆粒。有活性的病毒顆粒被(bèi)釋放到上清液中。快道病毒上清液可直接轉染或者濃縮後(hòu)轉染細胞。
當病毒感染靶細胞時(shí)，兒見病毒RNA被(bèi)反轉錄成(chén北但g)DNA，然後(hòu)永久性整合到宿鐘制主基因組。位于兩(liǎng)個LTR區域之間的FLEX Cre-Off開(冷如kāi)關連同其他病毒基因組組分永久整合到宿主基因從事組。在Cre重組酶的介導下，自定義啓動子調控下的目的基因的反轉ORF習近編碼方向(xiàng)從而實現目的基因個筆的表達沉默。
通過(guò)改造優化，我們的慢病場區毒載體删除了與病毒包裝和轉導相關的基因（這也視(zhè)些基因由輔助質粒進(jìn)行表達，用于病毒包裝過(guò)程書門），使産生的慢病毒顆粒是複制缺陷型的。即包裝的病錢就毒隻具有轉導靶細胞的能(néng)力，而無法在靶細胞車市中進(jìn)行大量複制，因而具有很高的生物安全性。
關于該載體系統的更多信息，請參考以下文獻。
| 參考文獻 | 主題 |
|---|---|
| J Virol. 72:8463 (1998)行自 | The 3rd generat開數ion lentivirus vec照妹tors |
| Nat Protoc. 1:241 (日友2006) | Production and p很花urification of lentiviral vectors |
| Gene. 216:55 (1998) | Characterization of LoxP mutants,動謝 including Lox2272 |
| Nat Biotechnol. 21:562 (2相筆003) | Development of the FLEX sw熱去itch system |
| J Neurosci. 28:7025 (2008) | Application of a FLEX switch system |
亮點
FLEX Cre-Off條件性表達慢病毒載體專爲在哺乳動物細關月胞中實現高效的目的基因調控表達而設計。目的基因受到用戶自定義的啓動子調節并且服船默認爲表達，但是可以在Cre重跳說組酶存在的情況下反轉ORF編碼水筆方向(xiàng)使目的基因失活。
我們目前采用的是第三代慢病毒包裝載體系統。經(jīng)優化，該載體在身現大腸杆菌體内具有很高的拷貝數，包裝的活病毒具有很高的滴度，對(但音duì)大多數宿主細胞具有高效的轉導能(néng)力，能(妹煙néng)有效地把載體整合到靶細胞基因組并實現外源基空服因的高水平表達。
優勢
基因失活可控：Cre重組酶存在的情況下，ORF方向(xiàng)轉爲反向(x友多iàng)，可防止基因發(fā)生洩漏表達。
基因穩定失活： 在Cre的存在下，LoxP和Lox2272位點對(d信討uì)分别重組，導緻ORF方向(xiàng)永久性地轉爲反向(購作xiàng)，且其中的一對(duì)重組位點將(jiāng)具有相同河亮的方向(xiàng)，Cre會(huì)介導産生正向(xiàng)重組切會雜割，繼而在ORF的兩(liǎng)端留下近筆兩(liǎng)個不同的Lox-變小公體，即使存在Cre也不會(huì)進(jìn)一步發(fā)計鐵生重組，使得目的基因的表達永久失活。
外源基因的穩定整合：常規質粒轉染隻能(néng)實現外源基因的瞬呢要時(shí)表達，這(zhè)種(z山生hǒng)外源基因會(huì)随著(zhe)宿主細胞的分裂而不線學斷丢失，在快速分裂的細胞中顯得尤爲顯著。相反的是，慢病毒轉導的目的基因能(n錢看éng)穩定地整合到宿主細胞的染色體中 ，因而會(huì)随著雜裡(zhe)宿主細胞的分裂而穩定遺傳。
滴度高：我們的病毒載體可以包裝出高滴度的病毒。我們提供短不的病毒包裝服務，病毒滴度可以達到>10工妹9 TU/ml。在這(zhè)樣(yàng)的病作麗毒滴度下，如果選擇合适的劑量去轉導體外培養的哺乳動物細胞朋樹，則轉導效率可接近100%。
宿主範圍廣泛：我們的病毒包裝系統包裝出來的病毒含有VSV放話-G包膜蛋白，此蛋白擁有非常廣雪看泛的親和性，可以轉導幾乎所有的哺乳動物細胞，包括分裂細胞，非分裂細胞，原身師代細胞，穩定細胞系，幹細胞，分化細胞，貼壁細胞和懸浮細胞等各類哺乳動物細胞姐妹，甚至還(hái)可以轉導一些非哺乳服子動物細胞。使用傳統的轉染方式轉導神經(jīn自劇g)元細胞是非常難的，但是采用我們慢病毒載體系統可以輕易的實現神經(jīn化樹g)元細胞的轉導。相對(duì)于在某些細胞中具有較村信低轉導效率的腺病毒和不能(néng)用于非分裂細胞的逆場了轉錄病毒而言，利用我們的慢病毒包裝系兒飛統包裝出來的病毒具有廣泛的親和性。
基因拷貝數相對(duì)均一：通常情況下，采用病毒轉導的方式可以比較均一的將(jiāng)外源基因轉入靶細我新胞中，而傳統的質粒轉染則呈現出較高的不均一性，導緻某些細胞會(huì)唱站獲得較多拷貝質粒而某些則會(huì)獲得較少甚至完問資全沒(méi)有。
體内外實驗均有效：我們的載體不僅擁有良好(hǎo)靜問的體外細胞轉導能(néng)力，同樣(yàng)光吧适用于體内活體動物實驗。
安全性高：我們的病毒載體系統具備了以下兩(liǎng)大特點，因而具有非常高的安錢們全性。一、病毒包裝和轉導所必需的基因由三個輔助質風但粒分開(kāi)表達。二、5' LTR的啓動子自失活。因那現此，在進(jìn)行病毒包裝和很林病毒轉導的時(shí)候不會(huì)産生具有複制能(n花公éng)力的病毒顆粒，使用我們的載體對(duì)人體的健康到科威脅也是最低的。
不足之處
載體容量受限：野生型的慢病毒基因組大小約爲9.2 kb姐計，而在我們的慢病毒載體中，病毒包裝和轉導的必要元北弟件約爲2.8 kb，餘下6.4 kb的空間容納客戶的目的為亮序列。當病毒載體超過(guò)以上大小限制，病毒的包裝滴度將(jiān厭離g)會(huì)大大降低。我們的慢病毒載體身朋除了可以插入靶基因的序列外，還(hái)可以插入啓低身動子和篩選标記等載體元件。如果目的基因和這(zhè)些載體元件長(chán去冷g)度超過(guò)了6.4 kb，病現討毒的産量有可能(néng)會(huì)明顯下降。
技術複雜：使用慢病毒載體時(shí)，需要在包裝細胞中産電件生活病毒，然後(hòu)測定病毒滴度。因此慢病毒轉染相也光對(duì)于常規質粒轉染，技術難度更高，周期更長(cháng)。
載體關鍵元件
RSV promoter: Rous sarcoma virus promoter.對愛 It drives transcription of viral R鐘暗NA in packaging cell姐現s. This RNA is then packaged 北玩into live virus.
5' LTR-ΔU3: A deleted ver子舞sion of the HIV-1 5' l廠市ong terminal re器上peat. In wildtype lentivirus, 5' LTR a紙媽nd 3' LTR are essentially ident藍章ical in sequence. They reside o上黃n two ends of the viral genome a工見nd point in the same directio的路n. Upon viral integration, the 3' LT區視R sequence is copied onto th做湖e 5' LTR. The LTRs carry b街爸oth promoter and polyadenyla木內tion function, such that in wildtype 朋從virus, the 5' LTR ac理是ts as a promoter to drive 知個the transcription of the vi水舊ral genome, while the 3' LTR 綠些acts as a polyadenyla樂輛tion signal to terminate the up裡業stream transcript. On our vector拍美, 5' LTR-ΔU3 is男器 deleted for a region that is r明商equired for the LTR's promot音員er activity normally facilita關車ted by the viral transcription fac票線tor Tat. This does not 業多affect the production of viral RNA身員 during packaging because the pr草農omoter function is supplemen行章ted by the RSV promoter e地窗ngineered upstream of 5現暗'LTR-ΔU3 LTR.
Ψ: HIV-1 packa答個ging signal required for the山車 packaging of viral 媽吧RNA into virus.
RRE: HIV-1 Rev response el也書ement. It allows the nu錢算clear export of viral RNA by the viral章頻 Rev protein during vi美北ral packaging.
cPPT: HIV-1 Central po用舞lypurine tract. It 微路creates a "DNA flap" that increases nu少線clear import of th人市e viral genome during 生頻target cell infection. This improves 學北vector integration into the hos聽家t genome, resulting in higher transduc遠路tion efficiency.
Promoter: The promoter dri從廠ving your GOI is placed here.
Lox2272: Recombination site for Cre recom金相binase. Mutated 兒不Lox site with two base s湖西ubstitutions of wild t友吃ype LoxP. Incompatib從站le with LoxP si林就tes. When Cre is present, th音林e LoxP and LoxP2272 si動匠tes will be cut and reco子火mbine with compatible sites.
LoxP: Recombination s資錢ite for Cre recombina冷內se. Incompatible with Lox2272 si月討tes. When Cre is present, the 窗高LoxP and Lox2272 site拍吧s will be cut and recombine w爸的ith compatible sites.
Kozak: Kozak consensus河跳 sequence. It is placed i分愛n front of the start codon of 服綠the ORF of interest because it 風外is believed to facilitate transl內兵ation initiation in e技街ukaryotes.
ORF: The open reading frame o吃問f your GOI is p開數laced here, in a sense讀店 orientation.
WPRE: Woodchuck he長我patitis virus posttra門河nscriptional re能了gulatory element. It enhances trans錯媽criptional termination in the 分姐3' LTR during vir工南al RNA transcription, which lead得數s to higher levels of信照 functional vira腦微l RNA in packaging cells and hence內會 greater viral titer. It also enha吃拍nces transcriptional 街鄉termination during the tra物票nscription of the user's GOI街謝 on the vector, 可朋leading to their higher 就現expression levels.
mPGK promoter: Mouse phosphoglycerate市厭 kinase 1 gene promo站但ter. It drives the ubiquitous express謝信ion the downstr能我eam marker gene.
Marker: A drug se報員lection gene (such as n要朋eomycin resistance), a visuall綠志y detectable gene (物要such as EGFP), or a亮科 dual-reporter gene (such as EG動知FP/Neo). This allows cells transduc物行ed with the vector to be 工我selected and/or vis還司ualized.
3' LTR-ΔU3: A truncated version章人 of the HIV-1 3' lo訊離ng terminal repeat that de體聽letes the U3 reg妹空ion. This leads to the self-inactivatio司白n of the promoter activity of the 5' LT窗畫R upon viral vector int理拿egration into the h區器ost genome (since the 3' LTR is co化來pied onto 5' LTR du都煙ring viral integration).議時 The polyadenylation signal舊又 contained in 3' LTR-ΔU3 serves to 草鐘terminates all upstream transcripts pro也身duced both during viral packa報聽ging and after viral integrati小銀on into the host genome.
SV40 early pA: Simian virus 40紙吧 early polyadenylation signal. I輛現t further facilitates transcrip報請tional termination after t北玩he 3' LTR during viral RNA音間 transcription during pa我南ckaging. This elevates the leve地煙l of functional viral RNA in packaging 家書cells, thus improving vir銀科al titer.
Ampicillin: Ampicillin resista秒腦nce gene. It allows the p冷得lasmid to be maintained業匠 by ampicillin selection in E. coli.
pUC ori: pUC origin of replication.讀慢 Plasmids carrying this origi作的n exist in high copy numbers in E. col票他i.
哺乳動物基因FLEX條件性表達慢病毒載體（Cre化朋-Off）
概述
FLEX條件性表達慢病毒載體結合了載體家的高師近效的第三代慢病毒載體系統和Cre響應的FL頻藍EX條件性基因表達載體，幫助您實現在病毒兒鐵宿主基因組上永久整合Cre重組酶響應的FLEX Cre-Off基因調控開(k那弟āi)關。FLEX Cre-Off系統利用位于目的基因兩(liǎng)側舞睡的Lox-變體重組位點，在Cre重組酶的調了輛控下目的基因發(fā)生反轉，目的基因正常錢司表達；而Cre不存在的情況下，目的基因不表達。
FLEX Cre-Off系統由兩(數綠liǎng)對(duì)異型Lox-變信一體重組位點組成(chéng)，其中野生型序國風列稱爲LoxP，突變體稱爲Lo腦能x2272，分别位于ORF的兩(liǎng)側。 兩(li白拿ǎng)種(zhǒng)Lox-變體都(dōu)男房可被(bèi)Cre識别，但隻有相同的Lo自我x位點對(duì)可以彼此重組，與其他Lox-變體不能(nén們坐g)進(jìn)行重組。 Lox相白P和Lox2272位點以交替方式位于ORF兩(liǎng)端高煙，每對(duì)位點互爲反向(xiàn腦高g)。Cre重組酶不存在的情況下，客戶定制的啓動子可以驅動目的基因的正常外算表達。Cre重組酶存在的情況下，LoxP和Lox2272位點對(d問區uì)分别重組，導緻ORF方向(亮美xiàng)反轉爲反向(xiàng)農上，且其中的一對(duì)重組位點將(jiāng)金術具有相同的方向(xiàng)，Cre會(huì)介導産生正向(xi小長àng)重組切割，繼而分别留下一個不同的重組位點。些討ORF方向(xiàng)的反轉，使得目朋飛的基因無法正常表達。由于ORF側翼是兩(liǎng)個不音筆同的Lox-變體位點，所以即使存在C就兵re也不會(huì)進(jìn)一步發(fā)生重組。
慢病毒載體首先以質粒的方式構建并使用E. coli擴增，然後(hòu)與愛家多個輔助質粒一同轉染至包裝細胞。載體上的兩(liǎng)個LTR區化謝域之間的DNA序列將(jiāng)被(bèi)轉錄成(chén舞如g)RNA，而輔助質粒表達的病毒蛋白進女花(jìn)一步與這(zhè)些RNA組裝形成(chén這看g)完整的病毒顆粒。有活性的病毒顆粒被(bèi)釋放到上清液中林近。病毒上清液可直接轉染或者濃縮後(hòu)轉染細胞。
當病毒感染靶細胞時(shí)，病毒RNA被(bèi)反轉錄遠國成(chéng)DNA，然後(hòu)永久性那見整合到宿主基因組。位于兩(liǎng)個LTR區域之間的FLEX Cr拿笑e-Off開(kāi)關連同其他病毒拍從基因組組分永久整合到宿主基因組。在Cre重組酶的介導下，自定義啓動子調控下的麗南目的基因的反轉ORF編碼方向(xiàng)從而實現目的基因的上湖表達沉默。
通過(guò)改造優化，我們的慢病毒載體删除了與病毒包裝和轉理路導相關的基因（這(zhè)些基因由輔助質粒進(jìn)行表達，用于病毒資子包裝過(guò)程），使産生的慢病毒顆粒是複制缺陷型的。即包裝的病毒隻具呢船有轉導靶細胞的能(néng)力，而無法在靶細胞中進(jìn)行大量錯農複制，因而具有很高的生物安全性。
關于該載體系統的更多信息，請參考以下文獻。
| 參考文獻 | 主題 |
|---|---|
| J Virol. 72:8463 (1998) | The 3rd generatio話新n lentivirus vec道機tors |
| Nat Protoc. 1:241廠我 (2006) | Production and pur中朋ification of lentivi唱劇ral vectors |
| Gene. 216:55 (1998) | Characterization微黑 of LoxP mutants, inc金些luding Lox2272 |
| Nat Biotechnol. 21:562 (2003) | Development of the FL見鐘EX switch system |
| J Neurosci. 28:7025笑窗 (2008) | Application of a FLEX switch sy媽電stem |
亮點
FLEX Cre-Off條件性表達畫站慢病毒載體專爲在哺乳動物細胞中實現高效的目的基因調控表達而設計。目的說水基因受到用戶自定義的啓動子調節并且默認爲表達，但是可以在Cre重組酶存在的算技情況下反轉ORF編碼方向(xiàng)使目的基因失活。歌南
我們目前采用的是第三代慢病毒包裝載體系統。經(jīn水跳g)優化，該載體在大腸杆菌體内具有很高的拷貝數器美，包裝的活病毒具有很高的滴度，對(duì)大多數宿主細胞具有高效的轉導能愛唱(néng)力，能(néng)有效地把朋從載體整合到靶細胞基因組并實現外源基因的高水平表達。
優勢
基因失活可控：Cre重組酶存在的情況下，ORF方錯輛向(xiàng)轉爲反向(xiàng)，可防止基因光聽發(fā)生洩漏表達。
基因穩定失活： 在Cre的存在下，LoxP和Lox2272位匠木點對(duì)分别重組，導緻ORF方向(xià店暗ng)永久性地轉爲反向(xiàng)，且其中的一對藍煙(duì)重組位點將(jiāng)具有相同船畫的方向(xiàng)，Cre會(huì)介導産生正向(xiàng)重組切舊新割，繼而在ORF的兩(liǎng)端留下兩自做(liǎng)個不同的Lox-變體，即使存在Cre也不會(huì)吃錯進(jìn)一步發(fā)生重組，使得目的厭城基因的表達永久失活。
外源基因的穩定整合：常規質粒轉染隻能(néng)實現外源基因的瞬時(shí)表達，這(z山銀hè)種(zhǒng)外源基因會(資小huì)随著(zhe)宿主細胞身河的分裂而不斷丢失，在快速分裂的細胞中顯得尤爲顯著。相反的是，慢病吃校毒轉導的目的基因能(néng)做秒穩定地整合到宿主細胞的染色體中 ，因而會(huì)随著(z跳技he)宿主細胞的分裂而穩定遺傳。
滴度高：我們的病毒載體可以包裝出高滴度的病能河毒。我們提供的病毒包裝服務，病毒滴度可以達到商國>109 TU/ml。在這(跳明zhè)樣(yàng)的病毒滴度下，如果選擇合适的劑量去身男轉導體外培養的哺乳動物細胞，則轉導效率可制內接近100%。
宿主範圍廣泛：我們的病毒包裝系統包裝出來的病毒含有VSV-G包膜蛋白，此蛋白擁有間南非常廣泛的親和性，可以轉導幾乎所有的哺乳動物細胞，包括分裂細胞，非分裂細胞南司，原代細胞，穩定細胞系，幹細胞，分化細胞，貼壁細胞和懸浮細胞等各類哺乳暗河動物細胞，甚至還(hái)可以轉導一些非哺乳動物細數筆胞。使用傳統的轉染方式轉導神經(jīng)元細胞是非制體常難的，但是采用我們慢病毒載體系統可以輕易睡街的實現神經(jīng)元細胞的轉導。相對(duì)于在某些細胞中具有較湖微低轉導效率的腺病毒和不能(néng)用于非分裂細胞的逆轉錄病毒綠書而言，利用我們的慢病毒包裝系統包裝出來的病毒具有廣泛謝生的親和性。
基因拷貝數相對(duì)均一：通常情況下，采用病毒轉導的方式可以比較均一的將(jiāng)外源基因轉呢有入靶細胞中，而傳統的質粒轉染則呈現出較高的年行不均一性，導緻某些細胞會(huì)獲得較多拷貝質粒而某些則會(huì)獲得較少空理甚至完全沒(méi)有。
體内外實驗均有效：我們的載體不僅擁有良好(hǎo)的體外細胞轉導能(néng關費)力，同樣(yàng)适用于體内話睡活體動物實驗。
安全性高：我們的病毒載體系統具備了以下兩(l現低iǎng)大特點，因而具有非常高的安全性。一、病件睡毒包裝和轉導所必需的基因由三個輔助質粒分開(kāi)表達。二、5' LTR的在音啓動子自失活。因此，在進(jìn)行農她病毒包裝和病毒轉導的時(shí)候不會(huì)産生具有複制能(néng)力暗腦的病毒顆粒，使用我們的載體對(duì)人體的健康威脅也是最低的。
不足之處
載體容量受限：野生型的慢病毒基因組大小約爲9.2 kb，而在我們的慢病毒載體中，作電病毒包裝和轉導的必要元件約爲2.8 kb，餘件還下6.4 kb的空間容納客戶的目的序列。當病毒載體飛也超過(guò)以上大小限制，病毒的包裝滴度將(jiān讀呢g)會(huì)大大降低。我們的慢病毒載體除了可以插入靶基因銀要的序列外，還(hái)可以插入啓動子和篩選标記等載體元件。如果目的基因和和體這(zhè)些載體元件長(cháng)度超過(guò)了6.4 kb，病毒的員票産量有可能(néng)會(huì)明顯下降。
技術複雜：使用慢病毒載體時(shí)，需要在東你包裝細胞中産生活病毒，然後(hòu唱這)測定病毒滴度。因此慢病毒轉染相對(duì)于常規質粒轉染聽的，技術難度更高，周期更長(cháng呢藍)。
載體關鍵元件
RSV promoter: Rous sarcoma virus pro影北moter. It drives transcription of vi新女ral RNA in packaging金明 cells. This RNA is the厭遠n packaged into live 謝坐virus.
5' LTR-ΔU3: A deleted version of the HIV-木關1 5' long terminal repeat.小金 In wildtype lentivirus, 5國亮' LTR and 3' LTR are不視 essentially ident門議ical in sequence. T北好hey reside on two ends of the viral影老 genome and point in the same dir這店ection. Upon viral i草購ntegration, the 3' LTR sequence is兵水 copied onto the 低通5' LTR. The LTRs carry both prom高門oter and polyadenylation function, su司視ch that in wildtype virus,秒遠 the 5' LTR acts as a promoter務外 to drive the transcri視飛ption of the vi到通ral genome, while the 3' 校黑LTR acts as a polya照票denylation signal to terminate the up舞舞stream transcript. On our vector, 5'見哥 LTR-ΔU3 is deleted 影月for a region tha你紅t is required for the LTR's pr算匠omoter activity normally術來 facilitated by the viral t音放ranscription factor Tat. This錯空 does not affect the production of vir關站al RNA during pa匠家ckaging because the promoter拿河 function is sup報站plemented by the 老都RSV promoter engineere少銀d upstream of 5'LTR習得-ΔU3 LTR.
Ψ: HIV-1 packaging signal 看志required for the packaging of viral 議火RNA into virus.
RRE: HIV-1 Rev respon水就se element. It allows the nuclear expo刀湖rt of viral RNA by 女日the viral Rev protein during兵爸 viral packaging.
cPPT: HIV-1 Central polypurin鐵喝e tract. It creates a "DNA flap" 相喝that increases nuclear import of如機 the viral genome during target c東視ell infection. This improve請科s vector integration into the host 去分genome, resulting in higher transdu農街ction efficiency.
Promoter: The promoter driving your唱離 GOI is placed here件工.
Lox2272: Recombinati得我on site for Cre還用 recombinase. Mutated Lo南笑x site with two base substitutions of 村靜wild type LoxP. Incompatible with Lox照路P sites. When Cre is光短 present, the LoxP and LoxP22有訊72 sites will be cu站家t and recombine with compatible site費站s.
LoxP: Recombination site for中看 Cre recombinase. Incompatible with Lox風國2272 sites. When Cre is pr舞商esent, the LoxP and Lox2272 sites wi話紙ll be cut and recombin空慢e with compatible sites.
Kozak: Kozak consensus sequence. It 快山is placed in front of t錢兒he start codon of t藍國he ORF of interest because it is beli飛裡eved to facilitate 車制translation initiation in euk東靜aryotes.
ORF: The open reading frame of your 有她GOI is placed her爸什e, in a sense orientation.
WPRE: Woodchuck 短冷hepatitis virus posttranscri吃河ptional regulatory el能人ement. It enhances tra銀鄉nscriptional termination 上志in the 3' LTR during viral RNA trans金件cription, which lea村件ds to higher levels of func年兵tional viral RNA in packaging c票拍ells and hence greater vir她算al titer. It also enhan這動ces transcriptional te嗎村rmination during the tr土舊anscription of the user's 黃理GOI on the vector,裡門 leading to their higher expres店微sion levels.
mPGK promoter: Mouse phosphoglycer睡信ate kinase 1 gen現冷e promoter. It drives th科道e ubiquitous expression the聽歌 downstream marker 又船gene.
Marker: A drug selec動音tion gene (such as neomycin生資 resistance), a visually detectab下員le gene (such as EGFP),得票 or a dual-reporter gene (such as EGFP/離些Neo). This allows cells 讀弟transduced with的高 the vector to be草嗎 selected and/or visualized.
3' LTR-ΔU3: A truncated 學錯version of the HIV-1 3' l知近ong terminal repeat that d睡和eletes the U3 region. Thi城車s leads to the s體器elf-inactivation of the promoter ac音問tivity of the 5' LTR upon v行從iral vector integration into the host雨商 genome (since the 3' L物刀TR is copied onto 5亮中' LTR during viral integration). The 了服polyadenylation signal contained in 3' 的裡LTR-ΔU3 serves to term火通inates all upstream t白金ranscripts produced both during vir公女al packaging and after viral integrat風黑ion into the host genome.
SV40 early pA: Simian virus 40 early polyadenyla話知tion signal. It further faci你物litates transcri門在ptional termination after the 3' LT喝通R during viral RNA transcription d畫們uring packaging. This e也月levates the level of func東妹tional viral RNA in packa北我ging cells, thus im土站proving viral titer.
Ampicillin: Ampicillin resistance gen錢雪e. It allows the plasmid to be ma藍章intained by ampicil嗎文lin selection in E. coli.
pUC ori: pUC origin of replication. 個可Plasmids carrying this ori木黃gin exist in high copy numbers in E. 醫為coli.