T-DNA雙元載體（用于植物轉間民化）

概述

基于雙元載體的農杆菌介導的遺傳轉化是制備轉基因也身植物的有效方法。該系統利用細菌根瘤農杆菌杆菌將(jiāng)外中票源DNA整合到多種(zhǒng)報業植物細胞基因組。

農杆菌雙元載體系統來源于天然腫瘤誘導（T多體i）質粒，農杆菌將(jiāng)Ti-質粒中的轉移DNA（分街T-DNA）區域整合到植物宿主基因組中。T-DNA笑通位于兩(liǎng)個25 bp的T-DNA邊界重複序列之間好廠，且兩(liǎng)個T-DNA邊界重複序列方向(x門唱iàng)相同。在我們的雙元載體系統中，所有與腫瘤形明門成(chéng)相關的序列都(dōu)黑線被(bèi)去除，僅留下T-DNA邊笑服界重複序列，兩(liǎng)個T-DN放水A邊界重複序列中間的目的序列將(jiā森外ng)整合到宿主基因組中。

完整的雙元載體系統由兩(liǎng)部分組成(chéng)。第一種(zh熱短ǒng)被(bèi)稱爲T-DNA雙元載體（或簡稱爲“雙元載體”）區街，包含兩(liǎng)個T-DNA重男站複序列，用戶感興趣基因將(jiāng)被(bèi)克隆到兩(腦物liǎng)個T-DNA重複序列之間。第二種(zhǒng)載體稱爲vir輔助國身質粒，負責編碼將(jiāng)兩(liǎng)個T-DNA重複序懂很列之間的區域整合到植物細胞基因組中所必需的組分。需要通過(城輛guò)共轉化、共電轉或融合的方式將(jiāng)這(zhè)兩(l人行iǎng)種(zhǒng)質粒一起舊那(qǐ)導入根癌土壤杆菌中，然後(hòu)使用該吧數菌株侵染宿主植株。

當雙元載體和vir輔助質粒共存于農杆菌時(shí)，由vir輔助質粒作上編碼的蛋白反式作用于T-DNA邊界重複元件以介導加工，分泌和宿主基因組的整媽看合。

關于該載體系統的更多信息，請參考以下文獻。

參考文獻	主題
Plant Physiolog音銀y. 146:325-32 (2008)	Review of T-DNA binary vector systems外制.
Trends in Plant Sc能農i. 5:446-51 (2000)	Review of T-DNA binary 見照vector systems.件家

亮點

我們的根癌農杆菌雙元載體系統能(nén購木g)夠有效地將(jiāng)序列插入到靶植株基因組中。雙元載體質粒上機經(jīng)過(guò)優化後(hòu慢懂)，能(néng)夠在大腸杆菌和農杆菌中進(jìn)行複制，可介導目的照雨序列高效整合到靶植物細胞中，實現外源基因個老的高水平表達。

優勢

外源基因的穩定整合：常規質粒轉染隻能(néng)實現外源基因的瞬時(sh些師í)表達，這(zhè)種(zhǒng)外源基因會(h離動uì)随著(zhe)宿主細胞的分裂而不斷丢失，在快速分裂的細胞中顯得尤爲光北顯著。相反的是，利用農杆菌侵染植物細胞可以將(jiāng)載體湖讀上的T-DNA區域的目的基因永久導入到宿主植物細胞中。

技術簡單：可用雙元載體直接轉化農杆菌或植物細和舊胞。

載體裝載量大：我們的農杆菌雙元載體可以容納長(cháng)達2黑紙0 kb的片段。

不足之處

3' 序列缺失：在植物細胞中，核苷酸降解通常會(huì)導緻T-DNA左邊界（3'）序列缺失。站什然而，由于用戶的目的序列被(bèi)克隆在中和右邊界附近，從左邊界開(kāi)始的日化降解僅會(huì)影響标記基因的表達。所南去以，關于這(zhè)一點并不需要過(guò)分擔心。

匹配的農杆菌菌株和标記：在進(jìn)行植物載體實驗時(shí)，必須注意選擇與特定雙的開元載體和抗性标記基因高效匹配的農杆菌菌株。例如，某些農杆菌菌株本綠飛身表達抗性基因，則具有相同篩選體有标記的雙元載體不能(néng)年要與該菌株匹配使用。

骨架序列的整合：在某些情況下，載體骨架序列可能(néng)輛山會(huì)與T-DNA邊界重複之間的序列一起(qǐ)開土發(fā)生整合。

載體關鍵元件

Promoter: The promoter driving your g城城ene of interest is placed her器多e.

Kozak: Kozak consensus sequenc船少e. This is placed in front of the st木友art codon of the ORF of音窗 interest to facili間筆tate translation initiat高得ion in eukaryotes.

ORF: The open reading f厭兒rame of your gene of interest is placed高錢 here.

Nos pA: The nopaline synthase po影購lyadenylation signal of Agroba舞離cterium tumefaciens. This 什人facilitates transc現就ription terminatio關朋n of the upstrea山黃m ORF.

RB T-DNA repeat: Right border repeat of T-DNA. Upon 音化recognized by Ti現器 plasmid in Agrobacter家但ium, the region between the T-美木DNA border repeats is transferred 愛用to plant cells.

pVS1 StaA: Stability protein from the 機老plasmid pVS1. Essent老場ial for stable plasmid segregat見遠ion in Agrobact生話erium.

pVS1 RepA: Replication prote睡金in from the plas微日mid pVS1. Permits replication of山風 low-copy plasmids in哥內 Agrobacterium.

pVS1 oriV: Origin of replication from the p對議lasmid pVS1. Permits replicatio農木n of low-copy plasmids in Agrobacter自秒ium.

pBR322 ori: pBR322 origin of re這上plication. Facilit熱船ates plasmid replication in E. coli. Pl一這asmids carrying this orig信要in exist in low copy numbers (15-20 pe動了r cell) in E. coli if Rop protein is音地 present, or medium co熱銀py numbers (100-300志廠 per cell) if Rop pro道花tein is absent.

Kanamycin: Kanamycin resistance gene. It al雜費lows the plasmid to be maintained by k東遠anamycin selection in b數玩acterial hosts.

LB T-DNA repeat: Left border repeat of T-DNA. Upon r術紅ecognized by Ti pla嗎計smid in Agrobacteriu風低m, the region between the T-DNA海醫 border repeats is 司員transferred to 子錢plant cells.

CaMV 35S_enhanced: A strong chimeric pr湖低omoter which drives mar事師ker expression.

CaMV 35S pA: Cauliflower mosaic virus 35S polya務民denylation signal. This facilitates 那不transcription termination and個朋 polyadenylation of the marker gene.熱理

Marker: A drug selection gene, allowing selec什快tion of plant cells transduced with th唱可e vector.

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