慢病毒載體（Lentivirus vectors）的特性：在非分裂和為什分裂細胞中穩定整合、轉基因的長(cháng)期表達、低免疫原性子著，使其成(chéng)爲基因治療的理想基因轉移載體。轉基因可以在非資師分裂或終末分化的非常靜止的細胞（例謝我如神經(jīng)元）中實現。我器習們的慢病毒載體來源于HIV-1病毒，序列經(jīng)過(gu見筆ò)精心優化，提高了生物安全性、基因表達水平和病毒轉導效率。慢病毒顆粒通常是時快在包裝細胞中共表達病毒體包裝元件和載體基因組來産生的。我些謝們開(kāi)發(fā)出了一系列專有技術和試劑，從病毒滴度、純度、活員公性以及一緻性等方面(miàn)提升了慢病毒包裝工藝水做會平。除了科研級别的慢病毒外，我們還(hái)提供GMP級别的慢病毒制備服務。
| 生産規格 | 總量 | 最小滴度 | 分裝 | 價格（CNY） | 周期 |
| 慢病毒小量制備 | >2.5x107 TU | >108 TU/ml | 10x25 ul | ￥3,180.00 | 6-12天 |
| 慢病毒中量制備 | >108 TU | >108 TU/ml | 10x100 ul | ￥4,680.00 | |
| 慢病毒大量制備 | >109 TU | >109 TU/ml | 10x100 ul | ￥7,780.00 | |
| 超純化慢病毒中量制備 | >5x108 TU | >109 TU/ml | 10x50 ul | ￥9,780.00 | |
| 超純化慢病毒大量制備 | >109 TU | >109 TU/ml | 10x100 ul | ￥11,880.00 |
| 生産規格 | 總量 | 最小滴度 | 分裝 | 價格（CNY） | 周期 |
| 二代慢病毒小量制備 | >2.5x107 TU | >108 TU/ml | 10x25 ul | ￥3,180.00 | 6-12天 |
| 二代慢病毒中量制備 | >108 TU | >108 TU/ml | 10x100 ul | ￥4,680.00 | |
| 二代慢病毒大量制備 | >109 TU | >109 TU/ml | 10x100 ul | ￥7,780.00 | |
| 超純化二代慢病毒中量制備 | >5x108 TU | >109 TU/ml | 10x50 ul | ￥9,780.00 | |
| 超純化二代慢病毒大量制備 | >109 TU | >109 TU/ml | 10x100 ul | ￥11,880.00 |
| 生産規格 | 總量 | 最小滴度 | 分裝 | 價格（CNY） | 周期 |
|---|---|---|---|---|---|
| 非整合型慢病毒小量制備 | >2.5x107 TU | >108 TU/ml | 10x25 ul | ￥3,180.00 | 6-12天 |
| 非整合型慢病毒中量制備 | >108 TU | >108 TU/ml | 10x100 ul | ￥4,680.00 | |
| 非整合型慢病毒大量制備 | >109 TU | >109 TU/ml | 10x100 ul | ￥7,780.00 | |
| 超純化非整合型慢病毒中量制備 | >5x108 TU | >109 TU/ml | 10x50 ul | ￥9,780.00 | |
| 超純化非整合型慢病毒大量制備 | >109 TU | >109 TU/ml | 10x100 ul | ￥11,880.00 |
| 非純化慢病毒制備服務 | 純化慢病毒制備服務 | |
| 交付内容 | 定制病毒，按照規格交付：
| 定制病毒，按照規格交付：
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對(duì)照病毒，按照定制病毒的規格對(duì)應贈送：
| 對(duì)照病毒，按照定制病毒的規格對(duì)應選購黃知：
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| Polybrene（5 mg/ml，20議兵0 ul），贈送 | Polybrene（5 mg/ml，200 ul），贈小鐵送 | |
輔助病毒，按照定制病毒的規格對(duì放匠)應選購：
| 輔助病毒，按照定制病毒的規格對(duì)應選購：
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| 病毒重懸液 | HBSS緩沖液 | HBSS緩沖液 |
| 運輸/存儲 | 幹冰/-80°C，避免反複凍融議書 | 幹冰/-80°C，避免反複凍融 |
| 推薦應用 | 體外培養細胞轉導 | 體外培養細胞轉導、動物體内細胞轉導 |
對(duì)照病毒
爲了更好(hǎo)地開(kāi)展您的實驗，我們按照“對(du村話ì)照病毒與定制病毒的生物學(xué)應用司林相匹配”的原則給您贈送或者推薦對(du樂很ì)照病毒。例如，如果定制病毒表達著都一個基因，則推薦的對(duì)照病毒表達熒光蛋白EGFP。如果定制病毒表員近達打靶某個基因的shRNA，則對(duì)照病毒厭計表達一個Scramble shRNA。推薦的對(duì)照病身她毒信息如下表所示：
| 對(duì)照病毒 | 對(duì)照載體名稱 | 對(duì)照載體ID | 定制病毒 |
| EGFP對(duì)照慢病毒，EGFP/mCherry雙熒光，Pur熱影o抗性 | pLV[Exp]-EGFP:T2A:Puro-EF1A&少少gt;mCherry | VB010000-9298rtf | 哺乳動物基因表達慢病毒（包含Te也河t-On誘導表達和FLEX條件性表達）、哺乳動物CRISPR慢病毒、哺乳動物非師筆編碼RNA表達慢病毒 |
| Scramble shRNA對(duì)照慢病毒，EG快鄉FP熒光，Puro抗性 | pLV[shRNA]-EGFP/Puro-U6>Scramble_shR員腦NA | VB010000-0009mxc | 哺乳動物shRNA幹擾慢病毒 |
| Scramble miR30-shRNA對(duì)照慢病毒，醫銀EGFP/mCherry雙熒光，Puro抗性 | pLV[miR30]-EGFP/Puro-EF購科1A>mCherry:Scramble_miR3關好0-shRNA | VB010000-9387zjj | 哺乳動物miR30-shRNA幹擾慢病毒 |
| TRE-mCherry對(duì)照慢病毒，EGFP/mChe你她rry雙熒光，Puro抗性（選購） | pLV[TetOn]-EGFP/Puro-TRE>m物去Cherry | VB010000-9449ujz | 哺乳動物基因Tet-On誘導表達TRE慢病毒 |
| FLEX-mCherry對(duì)照慢病毒，EGFP/mCherry雙熒光，輛草Puro抗性（選購） | pLV[FLEXon]-EGFP/Puro東火-EF1A>LL:rev(mCherry):rev(LL) | VB010000-9324qqg | 哺乳動物基因FLEX條件性表達慢病毒 |
輔助病毒
爲了更好(hǎo)地開(kāi)展您的實驗，我們按照“輔助病毒與定問請制病毒的生物學(xué)應用相匹配”的原則給您推火什薦輔助病毒。例如，如果定制病毒是一男藍個隻含TRE啓動子的TetOn慢病毒，則對哥需要一個表達rtTA的輔助病毒，媽地才能(néng)進(jìn)行誘導表達實驗。推薦的輔助病毒信息筆得如下表所示：
| 輔助病毒 | 輔助載體名稱 | 輔助載體ID | 定制病毒 |
| Cas9慢病毒，Hygro抗性（選購制山） | pLV[Exp]-CBh>hCas9/H開在ygro | VB010000-9380sne跳海 | 哺乳動物gRNA慢病毒（不含Cas9） |
MS2/P65/HSF1慢病毒（dCas的喝9-SAM系統元件之一），Hygro抗性（選購） 注意：該ORF序列存在特殊結構，使用其生産的慢病毒的滴度有可能(néng討習)會(huì)比同規格慢病毒的保證滴度低1-10倍。 | pLV[Exp]-EF1A>MS雪關2/P65/HSF1/Hygro | VB010000-9383ffr | 哺乳動物msgRNA表達慢病毒（dCas9-SA謝紅M系統元件之一） |
| dCas9/VP64慢病毒（dCas9-SAM系統舞好元件之一），Bsd抗性（選購） | pLV[Exp]-EF1A>dCas9/VP64/他術Bsd | VB010000-9384wwc | 哺乳動物msgRNA表達慢病毒（dCas9-SAM系統元件之一） |
| Cre慢病毒，Hygro抗性（選購） | pLV[Exp]-CMV>Cre/Hygro | VB010000-9372bck | 哺乳動物基因FLEX條件性表達慢病毒 |
| tTS/rtTA慢病毒，Hygro抗性（選購） | pLV[Exp]-CMV>tTS/rt來見TA/Hygro | VB010000-9369xhm | 哺乳動物基因Tet-On誘導表達TRE慢病毒 |
我們的慢病毒存儲在HBSS緩沖液中，并采用幹冰運輸。收到慢病毒後(hòu)兒購，立即放置于-80℃，長(cháng)期貯存至少6個月。廠外慢病毒的保質期約爲一年。請避免反複凍融，因爲這(zhè東唱)會(huì)導緻慢病毒滴度大幅下降。
| 步驟 | 描述 | 時(shí)間 |
Co-transfection開機 | 我們常規使用的第三代慢病毒包裝系統包括1個轉移質粒（Tra日快nsfer plasmid）、1個膜蛋白表達質粒（Env門事elope plasmid）、2個包購姐裝質粒（Packaging plasmid藍冷s），將(jiāng)這(zhè)些質粒共轉染包裝細胞。2個包裝質商拿粒分别爲Gag/Pol表達質粒和綠市Rev表達質粒。 | 第1天 |
Supernatant collection | 在細胞裡(lǐ)，轉移質粒轉錄出攜帶目的基因（長風Gene of Interest，簡稱GOI）的HI多錢V RNA基因組，與包裝質粒表達出的衣就科殼結構蛋白、酶、調控蛋白組裝成(chéng)病毒顆粒她報後(hòu)，轉運到細胞膜内側，形成(chéng)包膜病毒分泌到胞外。膜蛋白質習放粒表達的VSV-G膜蛋白錨定在細胞膜上，随著(z書市he)病毒成(chéng)熟，與細胞膜一起(qǐ)成金購(chéng)爲了病毒的膜。細胞短暫孵育後(坐到hòu)，收集上清，離心去除細胞碎片并過(習紙guò)濾。 | 第3天 |
Concentration and purif火雜ication | PEG濃縮病毒顆粒。對(duì)于超純化慢病毒（體内應用級别），現術采用蔗糖離心方法進(jìn)一步純化、濃縮病毒。 | 第4天 |
Quality Control | 對(duì)病毒進(jìn)行滴度測定（Titer determinatio廠一n）、微生物檢測（Biobur飛體den test，針對(duì)細菌、真菌）、支原體檢測（M和學ycoplasma test）等。 若轉移載體同時(shí)編碼一個熒光蛋白，我們還(hái)會(小愛huì)將(jiāng)病毒進(jìn)行細胞轉導以到線測定相應的熒光表達情況（Tran照大sduction test）。此外，對空少(duì)于超純化慢病毒，我們還(hái)可村微以檢測内毒素水平（Endotoxin test）。 | 第5天及以後(hòu) |
注意：第三代慢病毒包裝系統隻能(néng)包裝第坐呢三代的慢病毒轉移載體。但是第二代慢病毒包裝系統既能(nén聽見g)包裝第二代，也能(néng)包裝第三代的慢病毒轉移載會就體。第三代慢病毒轉移載體上的5’ LTR中些來的U3元件是被(bèi)一個外源啓動子替代（如CMV啓動子或者腦的RSV啓動子），使其不依賴Tat蛋白進制厭(jìn)行HIV RNA基因組的轉錄，故第三代慢病毒包裝系統的就謝包裝質粒不含Tat蛋白。第二代慢病毒轉移載體上的5’ 學土LTR是野生型的LTR，含有U3、R和U5元件，依賴Tat蛋白轉錄HIV 弟雜RNA基因組，故第二代慢病毒包裝系統的包裝質粒含有Tat靜下蛋白。
我們的滴度保證僅适用于這(zhè話年)樣(yàng)的轉移載體
對(duì)于如下這(zhè)樣(yàng)的轉移載體，我們不能人了(néng)保證滴度：
交付周期是指訂單接收到發(fā)貨之間的時(shí)間術件，不包括需要客戶提供任何物料（如病毒載體）的等待時(shí)間。對(duì)于南爸不含有熒光标記，但是含有藥篩标記的病毒載體，如果您需要獲得細胞睡愛藥篩效果的質檢結果，由于細胞生長(cháng)狀态明好需要較長(cháng)時(shí)間觀察，周期將(jiāng)額外增加8-業學10天。
如需客戶提供慢病毒載體，則請按照外來物品接收指南將(jiāng)載體寄送給我們。請歌厭嚴格按照我們的指南來進(jìn)行裝運以免造成(chéng)物品的任何延誤和低黃損壞。客戶提供的所有材料均需經(jīng)過(guò)QC檢測，每一份材很弟料附加檢測費用。請注意，客戶提供物品接收并通過(gu高又ò)QC之後(hòu)生産才正式開草開(kāi)始。
慢病毒轉導
使用說(shuō)明書
慢病毒體外應用慢病毒載體系統經(jīng)曆了至少三代演變發(fā)展，随費讀著(zhe)代次更新，生物安全性逐步提高。第一代系統（1st ge員見neration）雖然使用了三質粒系統，但是仍保留了大部分HIV基因飛懂組，安全性欠佳，現已基本淘汰。相比第一代系視山統，第二代系統（2nd generation）剔除了與病毒複制相關的跳看Vif、Vpr、Nef等輔助基因，僅保留了風弟與病毒轉錄、組裝相關的Gag、Pol、T司女at和Rev基因。值得注意的是，第場老二代系統的轉移載體是使用野生型 5年來‘ LTR啓動子轉錄HIV RNA轉錄本的。野生型 5‘ LTR啓麗還動子依賴Tat蛋白的結合才能(néng)激活其轉行去錄活性，所以第二代慢病毒的包裝必須使月著用第二代系統的包裝質粒，因爲它能(néng)表達Tat蛋白。
第三代系統（3rd generati市議on）在第二代基礎上做了這(zhè)些改進(務購jìn)：
1. 包裝質粒被(bèi)拆分成(ch家志éng)兩(liǎng)個，分别表達Rev和Gal/Pol，進(jìn)熱化一步降低了包裝質粒和轉移載體在包裝過(guò)程中産生D們個NA重組的幾率，從而降低形成(chéng外拿)複制型病毒的風險；
2. 包裝質粒上Tat基因被(bèi)去除姐就，進(jìn)一步降低緻癌的風險知我（Nunnari G 2008)。而轉移載體上的野生型5’ LTR元報舊件改造成(chéng)Hybrid 5'理身 LTR，删除了U3區域，并融合了強啓動子，如CMV或者RSV秒站啓動子，可以不依賴Tat轉錄H現是IV RNA；
3. 3’ LTR的U3區域被(bèi)删除，不熱區能(néng)將(jiāng)完整的3‘ LTR複制到5' LTR樹動上，原病毒DNA就(jiù)不能(nén地商g)自我轉錄生成(chéng)新的病毒R低樂NA，具有這(zhè)個特征的病毒被(就內bèi)稱爲自我失活型（Self inactivation，簡稱S照問IN）。第三代系統需要轉染四個質粒（1個轉移載體、2個包裝質粒、1個包膜蛋白表間懂達質粒），對(duì)生産技術會如要求更高一些。第二代慢病毒包裝質粒可以包裝第二、第三代的轉移讀樹載體，而第三代慢病毒包裝質粒系統缺少Tat，不能(néng)包裝第二代轉做畫移載體。
| 慢病毒 | MMLV | 腺病毒 | AAV | |
| 組織嗜性 | 廣泛 | 廣泛 | hAd5隻感染表達CAR受體的細胞 | 取決于血清型 |
| 是否可感染非分裂細胞 | 是 | 否 | 是 | 是 |
| 病毒基因組穩定整合抑或遊離于宿光西主基因組 | 穩定整合 | 穩定整合 | 遊離的DNA附加體形式 | 遊離的DNA附加體形式 |
| 自定義啓動子 | 是 | 否 | 是 | 是 |
| 應用 | 細胞培養和體内實驗 | 細胞培養和體内實驗 | 體内實驗 | 體内實驗 |
| 體内免疫反應 | 低 | 低 | 高 | 非常低 |
我們使用p24 ELISA法測定慢病毒滴度。該方法的三明治免疫試驗可測定H習窗IV-1 核心蛋白p24在慢病毒上清液中的含量水平。我們首先在子你微量滴定闆上加入慢病毒樣(yàng)本，然後(hòu)每孔匠現加入HIV-1 p24捕獲抗體進(jìn)行孵育，并随後(hòu錢兒)添加生物素化的p24二抗以結合p24一抗。此後(h西能òu)，樣(yàng)本中加入的辣根過(guò)氧化物笑笑酶（HRP）标記的鏈黴親和素可特異性結合的嗎生物素化的p24二抗。在最後(hò用國u)一步中，加入辣根過(guò)氧化物酶底物反應液，經(jīng)HRP催化行風産生有顔色的産物。每個孔的顔色深度最終反映了慢病毒樣(yàng)本中的p24含兵玩量。使用分光光度計測量的樣(yàng)本吸西就光度數值與重組HIV-1的 p24标準曲線進(jìn)行對(duì)照，然明煙後(hòu)被(bèi)換算爲對(duì)應的慢病毒滴度。
野生型慢病毒HIV-1的基因組船計長(cháng)度約爲9.2 kb，這(zhè)也是重組慢病毒白冷載體的承載限度範圍。載體上能(néng)包裝進(jìn)病毒的區域長(chán北是g)度爲從5’ LTR的R元件的第一個堿基到湖睡3’ LTR的R元件的最後(hòu)一個堿基。超出承載量算花的片段插入則會(huì)造成(chéng)哥用病毒包裝滴度降低。
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