哺乳動物CRISPR（雙SagRNA表達）ssAAV載體

CRISPR/Cas9（規律成(c火器héng)簇的間隔短回文重複序列及相關蛋白9）核理金酸酶表達載體屬于幾種(zhǒng)新興的基因組編輯工具之一（另外兩(l通務iǎng)種(zhǒng)是ZFN和TALEN）科房，可在基因組的靶位點快速有效地産生突變。這(zhè)些質粒載體編碼的特異慢公性RNA，能(néng)夠引導D農資NA核酸酶（或缺刻酶）編輯基因組中特定位鄉了點的DNA序列。

Cas9是RNA引導DNA核酸酶，是天然原核免疫系統的一部分，賦予細菌站知産生對(duì)質粒和噬菌體等外源遺傳物質的抵抗能(néng)力。在算暗細胞内，Cas9核酸酶與引導RNA（gRNA）形成(chéng)好相複合物，該複合物通過(guò)與基因組中的18-22 nt的同源靶序章動列直接相互作用，gRNA與靶位點通過(guò)制北互補配對(duì)使Cas9定位到靶序列上，靜好然後(hòu)切割基因組中的靶位點。爲了方便使用，我們設計的CRIS雪愛PR/Cas9載體能(néng)夠在一個載體上同時(少坐shí)有效表達Cas9核酸酶（或缺刻酶）和引導RNA（gRNA）。

使用CRISPR打靶目的基因需要場事目标細胞同時(shí)表達Cas9和特異gRNA。這水日(zhè)可以通過(guò)在同一個載體上共表達Cas個刀9和gRNA，也可以通過(guò)在兩(liǎng)個載體各上自表達Cas時術9和gRNA來實現。使用Cas9和gRNA兩(liǎng)個載體分開樹對(kāi)表達的優勢在于可使用不同的gRNA與不同的Cas南雪9變體組合（如Cas9n，dCas9），從而帶來更多變的實驗方案。

我們的AAV SagRNA表達載體是專門搭配SaCas9使用的。S子謝aCas9來源于Staphylococcus aureus，其序列遠厭比來源于Streptococcus pyogen你區es的SpCas9要短1 kb以上。因此較小長(c下是háng)度的SaCas9序列更适合小裝載量的AAV病毒的包裝生紙北産。SaCas9與SpCas9有兩(liǎ志是ng)個方面(miàn)的差異：第一，SaC的什as9要求搭配的gRNA的骨架序列與SpCas9要求的不同章拍。與SaCas9适配的gRNA叫(j可筆iào)SagRNA；第二，SaCas9識别的PAM序列是NNGRR（優熱唱先NNGRRT），而SpCas9識别的PAM序列爲NGG（民鐵較多情況）和NAG（少數情況）。

我們的AAV SagRNA表達載體既可以表哥弟達單SagRNA也可以表達雙SagRNA微鐵。單SagRNA被(bèi)常用于傳統的基因編輯如基因敲除，而雙SagRNA城在适用于需要用2個gRNA同時(shí)打靶基因組家媽兩(liǎng)個區域的情況，如造成(chéng)兩(liǎn體分g)個DSB之間的片段删除，同時高西(shí)打靶兩(liǎng)個不同的鐵農基因等當一個SagRNA載體上含有單個廠黑人U6啓動子時(shí)可以驅動兩(liǎng)個ITR區呢新域之間的單SagRNA表達。雙SagRNA載體則含有兩(著內liǎng)個U6啓動子用以驅動兩(liǎng)個特異于打靶序列的Sa化這gRNA表達。

AAV SagRNA表達載體首先在構建可在E. coli中複制的質粒新少DNA，然後(hòu)與輔助質粒一并轉染至包裝細胞。位于載體上的兩(l雜子iǎng)個ITR區域之間的序列將(jiāng)被(bèi)包裝至有活性的病頻那毒顆粒當中。病毒轉導時(shí)，兩(liǎng)個ITR區域之公快間的SagRNA表達盒連同病毒基因組的其他組分都(dōu)會(huì)進(j家這ìn)入靶細胞。表達盒中的人源U6啓動子將(j厭市iāng)驅動SagRNA序列轉錄。SagRN做遠A随後(hòu)引導SaCas9短業打靶目的序列。

野生型AAV基因組（ssAAV）是一條線性單鏈DNA分子（ssDNA友去），并含有兩(liǎng)個ITR區域在基因組的兩(liǎng)端形成(c來美héng)發(fā)夾結構。ssAAV在細胞内進(jìn)行表達時(shí)，腦妹其基因組首先需要被(bèi)轉化成(chéng)雙鏈D開火NA（dsDNA），這(zhè)個過(guò)程有兩(liǎng)個途徑：1.要煙 使用宿主細胞的DNA聚合酶和ssAAV基因組子火上的3’ ITR序列作爲引物結合點合成(c廠暗héng)第二鏈DNA；2. ssAAV基因組的正義鏈和木你負義鏈之間形成(chéng)分子内的dsDNA結構。兩(liǎn睡內g)種(zhǒng)途徑中前者是形成(chéng這這)dsDNA的主要方式。

AAV線性雙鏈DNA基因組在細胞核内會(huì我現)形成(chéng)遊離形式的多聯體。在非分答們裂細胞中，這(zhè)些多連體會(huì)長(cháng道信)久存在直到宿主細胞死亡。而在分裂細胞中，遊離的DNA多聯體會(huì銀去)因爲細胞分裂而被(bèi)稀釋，這(錢近zhè)是因爲遊離DNA不能(néng線行)随著(zhe)宿主基因組複制而複制。AAV基因組随機整合宿主長生基因組的概率是很小的。AAV的這(zhè)種(zhǒng)謝看特性對(duì)于應用于基因治療是可貴的，快廠因爲載體上的外源DNA整合宿主基因組的通這情況是有潛在的緻癌性質的。

AAV的一個主要優點是，在大多數情況下，可以在生物你購安全1級（BSL1）設施中操作。AAV是複制朋好缺陷型的、不會(huì)引起(qǐ)炎症反應和引發(fā)人類疾病。有賴我多于AAV對(duì)宿主的低免疫原性，我們的ssAA風站V gRNA表達載體是體内CRISP弟影R應用的完美工具。

人們已從自然界中鑒定出許多AA站一V病毒株，根據病毒表面(miàn)衣殼蛋白鄉如的不同抗原將(jiāng)它們分成(chéng)不同的血清型。不同血清型的病毒事海具有不同的組織親和性（即感染組織老紙特異性）。當我們的AAV載體使用不同的衣殼蛋麗上白包裝病毒時(shí)，則會(huì)賦予病毒不同的血清型。影物AAV包裝時(shí)的ITR序列來源于AAV2，這(zhè)是場如一種(zhǒng)常用的AAV載體構校頻建方式，不影響血清型。另一方面(miàn)，決定窗放血清型的衣殼蛋白基因由Rep/Cap包裝質粒編碼。下表列出理們了不同的AAV血清型及對(duì海醫)應的組織嗜性。

關于該載體系統的更多信息，請參考以下文獻。

難以轉導特定類型的細胞：當利用合适的血清型進(jìn)行包裝時(shí)，我們的AAV載體系統可以朋快轉導很多不同類型的細胞，包括非分裂細胞。不同AAV血清型對答都(duì)不同類型的細胞具有不同的嗜性，針對(duì)某種(z會會hǒng)特定類型的細胞需要特定血清型。

技術複雜：使用AAV病毒載體時(shí)，需要在包裝細胞中産生活病毒，然後妹些(hòu)測定病毒滴度。這(zhè)些過(guò)程相對(duì水空)于常規質粒轉染，技術難度更高，周期更長(cháng)都都。在訂購載體的同時(shí)，可哥嗎以通過(guò)訂購我們的病毒包裝服務輕松解決這(zhè雨土)些問題。

PAM序列依賴：我們的AAV SagRNA表達載體是搭配來源于Staphylococcu嗎快s aureus的SaCas9使用的。SaCas9介導的CRI媽理SPR打靶依賴于位于gRNA識别序列冷上3’末端的PAM序列NNGRR體民（優先NNGRRT）。