進(jìn)一步了解 >> 我們的質量體系通過(guò)ISO區見 9001認證。這(zhè)些産品是在我們先進(jìn)的設施中火內嚴格控制下生成(chéng)的。

Dual-gRNA慢病毒文庫

雲舟生物提供的Dual-gRNA慢病毒文庫可用于人或者可學小鼠細胞的全基因組敲除篩選實驗。我們將(jiāng)人類和小鼠的Dual-g唱海RNA文庫被(bèi)制備成(c錢長héng)即用型的慢病毒文庫，分别靶向(xiàng)機藍20,048個人類基因和20,493個小鼠基因，每樹答個基因被(bèi)4-6對(duì)不同的gRNA打靶遠東，這(zhè)些gRNA分布在多個載體。這(zhè)些文師化庫是高效、實惠的基因組範圍功能(畫書néng)喪失篩選實驗工具。此外，我們還(hái)可以根據您提供的基因列表制劇土備相應的gRNA混合文庫。

訂購信息
産品名稱靶基因數量gRNA對(duì)數量規格*貨号價格（CNY）
人類全基因組Dual-gRNA慢病毒文庫20,04891,926

中規格

(>1.0x108 TU/ml, 1 ml)

LVM(Lib190505-1046fgb)￥20,980

5x中規格

(>1.0x108 TU/ml, 5 ml)

LV5M(Lib190505-1046fgb)￥24,480
小鼠全基因組Dual-gRNA慢病毒文庫20,49390,344

中規格

(>1.0x108 TU/ml, 1 ml)

LVM(Lib190505-1050kpm)￥20,980

5x中規格

(>1.0x108 TU/ml, 5 ml)

LV5M(Lib190505-1050kpm)￥24,480

* 中規格的病毒量足夠在100x fold 唱一coverage下進(jìn)行＞5次篩選； 5大近x中規格的病毒量足夠在100x fold coverag了能e下進(jìn)行＞25次篩選。

逆卷積（Deconvolution）服務

不清楚如何使用NGS鑒定篩選實驗後(hòu)的gRNA打靶情況？您可將(j黑分iāng)樣(yàng)本的基因組DNA發(fā)送給哥雨我們，我們會(huì)制備NGS文庫，高通量測序并進(jì從件n)行數據分析，隻需幾周即可將(jiā內但ng)每個樣(yàng)本的gRNA計算發(fā)冷校送給您。 如需該服務，請點擊“發(fā)送需求咨詢”將(jiāng)需求發(fā)送給我們。
技術詳情
獨特的Dual-gRNA設計：文庫中每個慢病毒載體包含兩(liǎng)個gRNA表達盒子和地短一個EGFP/puromycin雙标記基因表達盒子（圖1）。載體一經(jīng)導入細胞，同一載體上兩(liǎng)個gRNA同時(s上鄉hí)表達，靶向(xiàng)同一基因的兩(liǎn關購g)個不同位點，産生兩(liǎng)個DNA切口，随後(hòu)造票商成(chéng)基因功能(néng)缺失。每個載體上的兩(liǎ美視ng)個gRNA由兩(liǎng)個不同的U6啓動子（人U6啓動子和猴U6啓刀你動子）以及兩(liǎng)個不同的gRNA scaffold（見于Nat 費志Methods. 14:573 (2017)）組成(chéng)費化。gRNA scaffold序列和習不同，但功能(néng)相當。這(zhè)樣(yàng)的獨特設計，降低海道了兩(liǎng)個gRNA表達盒子序如些列之間的同源重組幾率，同時(shí)利于從轉導文庫的細胞中進場行(jìn)行PCR擴增以及通過(guò)NGS對(duì)上遊gRNA、下遊g車通RNA或者兩(liǎng)個gRNA進(jìn)行測序。
圖1 Dual-gRNA慢病毒載體圖譜

查看Dual-gRNA慢病毒載體圖譜和序列 >>


全基因組/高覆蓋率打靶： 人類和小鼠Dual-gRNA慢病毒文庫分别打靶20,048個人類基笑雨因和20,493個小鼠基因，平均每個基因被(bèi)4-6對(duì)我制不同的gRNA打靶，這(zhè)些gRNA是通過(guò)一系列參數篩選玩熱設計出來的，包括：1）計算脫靶得分，將(jiāng)脫靶風險大大降低；短銀 2）計算切口位點位置，确保兩(l懂錯iǎng)個位點之間的片段缺失能(néng)造成(chéng)吧藍基因功能(néng)缺失；3）地林計算切口之間的距離，确保突變傾向相員(xiàng)于形成(chéng)跨越切口的大片段缺失，而信城不是每個切口的局部突變；4）計算每個基因中被(bèi)影響的轉錄本數目，确保些場所有轉錄都(dōu)盡可能(néng)敲除。所有的gRNA可切割位點均大站位于外顯子内。因此，即使不能(néng)産生大片段缺失，單個位點的局部突變（通草電常爲幾個到幾十個堿基缺失/插入）同樣(yàng)能(néng)山舊破壞基因功能(néng)。
NGS驗證文庫質量：采用NGS驗證Dual-gRNA慢病毒文庫的每一個載體的gRNA序列。鑒定吧少結果顯示，NGS測序讀數與理論的人類Dual-gRNA文庫、小鼠Du多照al-gRNA文庫的匹配率分别是&g資就t;87%和75%。此外，人類Dual-gRNA文庫中，>99%的理論g如影RNA序列被(bèi)NGS檢測到。在小鼠Dual-gRNA文庫中，體化>97%的理論gRNA序列被(bèi)NGS檢測到。因此，這(zhè)兩做問(liǎng)個文庫的gRNA均雨地具有很高的覆蓋率和很低的錯誤率。你暗據我們所知，這(zhè)是目前所報道(dào)的質量最高的雙gRNA文庫。

高度均一性：兩(liǎng)個文庫的gRNA均表到紙現出高度的均一性（圖2）。
圖2 兩(liǎng)個文庫的gRNA分布。ghRNA讀長(cháng)分布就這按NGS文庫大小（1000萬reads）标準化，并以log2比例繪制。數好

完善的慢病毒載體和即用的高滴度慢病高船毒：Dual-gRNA文庫采用第三代慢病毒載體表達，該系統能(néng)在多種(z人歌hǒng)細胞中高效表達。由于能(néng)見我將(jiāng)gRNA文庫高效地、永久性地、均一地導入細胞，該慢病毒載舊也體系統是體外篩選的理想工具。Dual-gRNA文庫以即用型科學慢病毒形式提供，病毒滴度高（>108 TU/ml），節省了病毒包裝和滴度測定的時(sh兒工í)間。該慢病毒載體是自我複制缺陷型，更具很高的生物安全性。

高效篩選/追蹤陽性轉導細胞的雙标記基因：慢病毒載體含有表達EGFP熒光報告基因和puromycin抗性基因（Puro）開山的基因表達盒子，允許添加puromycin抗生素和使飛吃用綠色熒光來篩選/追蹤陽性轉導細胞（圖3）。
圖3 人類全基因組Dual-gRNA慢病毒文庫（MOI=10唱討）轉導293T細胞後(hòu)，接著(zhe)Puromycin篩選（1.5門木 ug/ml）4天後(hòu)的EGFP表達情況。左：明視也和野；右：綠色熒光視野。
圖4所示爲使用Dual-gRNA慢病毒文庫進(jìn商計)行基因篩選的工作流程。首先，用慢病毒文庫轉導表達Cas9的目高嗎的細胞，通過(guò)慢病毒載體上攜帶的标記基因篩木兵選陽性轉導細胞（如藥篩基因或者熒光标記基路場因）。接著(zhe)，將(jiāng)陽性轉導細胞分成(chéng)兩(li理兵ǎng)群細胞：對(duì)照組和實驗組。然後(hòu)，對(duì)實驗組細什作胞進(jìn)行特定選擇壓力實驗（如藥物處理或者重複傳代）畫兵來篩選出具有理想表型的細胞。在這(zhè)個環節，通常有三種看司(zhǒng)常用的篩選策略：1）細胞活司子性篩選：篩選出在選擇壓力下gRNA富集或者丢失的存活細胞；2）報告基因技制表達篩選：篩選出報告基因表達變強或變低同時(shí來分)gRNA富集或者丢失的細胞（如，gRNA唱著打靶調控報告基因的轉錄因子）; 3）玩電細胞行爲篩選：篩選出與細胞入侵、遷和學移等行爲基因相關gRNA。篩選後(hòu)，收集實驗組和喝海對(duì)照組細胞，使用Sa老船nger測序或者二代測序（NGS）鑒定出在實驗組（相對(du行師ì)于對(duì)照組）中變多了或者變少了的gRNA著年。最後(hòu)，可通過(guò)下遊功能(nén分關g)實驗進(jìn)一步探究那些理論上被(bèi拍腦)富集或者丢失的gRNA打靶的基因。
圖4 采用Dual-gRNA慢病毒文庫實現基因敲除篩選的工作流程。 引用來源窗光： Acta Biochim Biophys Sin 44:103-112 業間(2012)
常見問題解答

Dual-gRNA文庫要比Single-gRNA文庫強大的多，這(zhè業鐵)是由于Dual-gRNA文庫引入的大片段缺失在産生基因功能(nén放上g)缺失上更高效。每個慢病毒載體含有一對(duì)gRNA影是表達盒子，這(zhè)對(duì)gRNA打靶同一個基因。導報分入Cas9蛋白表達細胞後(hòu)，每個載體能(néng)夠在一個基因上從他産生兩(liǎng)個切口。細胞修複這(zhè)兩(liǎng)數為個切口的時(shí)候，往往傾向(xiàng)冷那發(fā)生兩(liǎng)個切口之間的大片段缺失。這(zh話道è)兩(liǎng)個切口通常被(bèi)設計在目的基因的重要區域上，務國當兩(liǎng)個切口之間的片段缺失後(hòu)請算，目的基因的功能(néng)也會(huì)高山喪失。

對(duì)于CRISPR敲除篩選，我應該使用單載體系統還(hái)是腦劇雙載體系統？▼

對(duì)于典型的敲除篩選實驗，CRISPR文庫構建可以采用單載的動體或雙載體系統。在單載體系統中，Cas9或Cas9變那刀體與來自同一載體且與gRNA共表達，而在雙載體系統中，Cas9或C視服as9 變體和gRNA由兩(liǎng)個單獨的載體表達。此外，在雙拿新載體系統中，可以將(jiāng)表達gRNA的載體近筆引入穩定表達Cas9的細胞系中。使用單載體系統的優點是它無需將(jiān問器g)兩(liǎng)種(zhǒng)不同載體共轉草冷染/轉導到細胞中，并且不要求使用表達Cas9的穩定細胞系。然訊機而，與雙載體系統相比，它的通用事謝性較差，并且在載體克隆和病毒包裝方面(miàn)的長有效率較低。

gRNA特異性分值是如何計算的？我北 ▼

我們使用的gRNA設計和評分使用了 CRISPR文庫設計（CLD靜煙）中的規則。簡而言之，對(duì)于每個暗紙物種(zhǒng)，我們找出符合N(20)NGG規則的靶序列，把錯配堿基 草街≤3的序列列爲潛在的脫靶位點，計算出每個gRNA的脫靶分值，進(jìn)而得醫讀出最終的gRNA特異性分值。gRNA請車特異性分值在0-100之間，分值越大靶向(xiàng)特異紙物性越高。

請注意特異性分值隻是一個參考值。實際的靶向(xiàng)效率和特醫花異性可能(néng)會(huì)與預測人業的分值有偏差，低分值的gRNA也可能(néng)有較好(hǎo)是聽的靶向(xiàng)效果。

相關服務

文庫構建 
CRISPR基因編輯解決方案 
載體構建 
病毒包裝 

載體設計