哺乳動物基因表達piggyBac載體

概述

PiggyBac載體系統可以非常高效地把外源DNA插入哺乳動物細胞的基因組，哥生該系統技術簡單，可利用質粒轉染（非病毒轉導）把您所感興務業趣的基因長(cháng)期穩定地整合科要到靶細胞基因組。

該系統來源于piggyBac轉座子，最開(美鄉kāi)始在粉紋夜蛾（Tricho腦麗plusia ni）中發(fā)現并快關分離而來。基于序列同源性分析，piggyBac轉座子是許多常見物種(zhǒng腦城)共有的一類轉座子。

PiggyBac系統包含兩(liǎng)個組分，信得一個組分爲PBase轉座酶（通常爲表達PBase師銀的IVT mRNA）；另一個組分被(b算了èi)稱爲轉座子質粒，包含兩(liǎng)個末端重複序還低列（TR）以及兩(liǎng)者之間的被(bèi)轉座區習刀域，需要被(bèi)轉座到宿主基因組中的目的基因就(jiù)克隆在這(zhè)吧近個區域。

當表達PBase的IVT mRNA和轉座子質粒共轉染靶細胞時(動劇shí)，PBase IVT mRNA産生的轉座酶將(jiān也自g)會(huì)識别轉座子的兩(liǎng)個TR元件，然後(hòu)將(ji拿關āng)被(bèi)轉座區和兩(liǎng)個TR元件插入到宿空金主基因組中。轉座插入通常發(fā)生在包含TT自森AA序列的宿主染色體位點，并在轉座子兩(liǎng)側出現TTAA重複序列。

PiggyBac屬于II類轉座子，通過(guò視公)“剪切—粘貼”的機制移動，從一個地方轉座到另一個地方，而不留下序列拿筆本身（恰好(hǎo)相反，I類轉座子是通過(guò)“複制—粘貼”的方式見子移動）。由于輔助質粒是通過(guò)瞬時(shí)轉務從染進(jìn)入宿主細胞的，故會(huì)逐漸內靜丢失。随著(zhe)輔助質粒的丢失，轉座子在宿主基因組中變成(ché書用ng)了永久整合。當這(zhè)些宿主細胞媽還再次被(bèi)輔助質粒轉染，整合的轉座子會(huì)喝視再次通過(guò)“剪切—粘貼”的機制移動。

關于piggyBac基因表達載體系統的更多信息，請參考以下文人間獻。

參考文獻	主題
Mol Cell Biochem. 354:301 (2011)	Review
Cell. 122:473 (2005)	Efficient transposition of th科鄉e piggyBac (PB) transposon in mammal低黃ian cells and mice

亮點

我們的piggyBac轉座子載體與輔助質粒是經(jīng)過(火工guò)優化的，可在大腸杆菌中高訊跳拷貝複制。該載體系統對(duì兒她)多種(zhǒng)類型的靶細胞均具有高喝東效的轉導效率，實現外源基因的高水平表達。費快

優勢

外源基因的永久整合：常規質粒轉染隻能(néng)實現外源基因的瞬時(shí)表達，這(zhè輛校)種(zhǒng)外源基因會(huì)随著(zhe)宿主細胞的分厭知裂而不斷丢失，在快速分裂的細胞中顯得尤爲顯著。相光雨反，將(jiāng)piggyBac轉座子載體和輔助質粒一起(qǐ)轉染到資裡哺乳動物細胞中，由于轉座子在轉座酶的作用下，目的基因舞理能(néng)穩定地整合到宿主細胞的染色體中，從而實現轉座高的子載體上攜帶的目的基因在宿主細胞裡是中永久表達。

技術簡單：通過(guò)常規轉染即可把質粒轉入細胞，相比起(qǐ)病毒載要輛體需要進(jìn)行病毒包裝，過(gu影她ò)程更簡單。

載體容量大：我們的轉座子載體總容量可達30歌南 kb，其中質粒骨架隻占3 kb，有足夠大的容量可以放置客戶所感興趣的序列。

不足之處

轉染細胞類型受限：PiggyBac載體進(jìn)入細胞依賴男近于轉染。不同類型的細胞，其轉染效率差異非常大。非分聽照裂細胞通常比分裂細胞更難轉染，原代細胞比永生化細北文胞更難轉染，一些重要的細胞類型轉染難度更大，如神經(jīng)元和胰島愛信β細胞。另外，質粒轉染主要局限于體外應用，很器吃少應用于體内實驗（但可以應用于轉基因動物模型制備）。以上動中因素在一定程度上制約了piggyBac系統的應用。頻妹

載體關鍵元件

5' ITR: 5' inverted terminal repeat. When a D文年NA sequence is fl煙子anked by two ITRs, the piggyBac tr爸舞anspose can recognize the工妹m, and insert the flanke日學d region includi如河ng the two ITRs into the host ge道黑nome.

Promoter: The promoter dr離放iving your gene of interes城女t is placed here.

Kozak: Kozak consensus seque湖到nce. It is placed in front of the 要房start codon of the ORF of interest beca西草use it is believed to faci對還litate translation initiation in 們大eukaryotes.

ORF: The open reading frame of your 兵作gene of interest is placed here.兒姐

rBG pA: Rabbit β-globin polyadenylation 司女signal. It facilitates tran樹亮scriptional termination of the upstr嗎姐eam ORF.

CMV promoter: Human cytomegalovirus immediate ear那近ly promoter. It我錢 drives the ubiquitous expr和區ession of the downstream marker gene.人些

Marker: A drug selection gene (such as 外他neomycin resistance),南冷 a visually det請長ectable gene (s著多uch as EGFP), or a dual-你道reporter gene (such as E看體GFP/Neo). This al鐘愛lows cells transd知木uced with the vector to be sele紅冷cted and/or visuali遠物zed.

BGH pA:Bovine growth horm兵短one polyadenylat問老ion signal. It f站花acilitates transc和你riptional termination of the 笑低upstream ORF.

3' ITR: 3' inverted terminal re風藍peat.

Ampicillin: Ampicillin resistance gene.理下 It allows the plasmid to be mainta來國ined by ampicil費術lin selection in E. coli.

pUC ori: pUC origin of replication. Plasmi話森ds carrying this origin exist 兒也in high copy nu我中mbers in E. coli.

Representative vector design

VB ID	Vector name	Descriptions
VB010000-9491dkf	pPB[Exp]-EF1A>EGFP/Neo	A PiggyBac transposon vector e離好xpressing EGFP: neomycin 什爸resistance fusion protein driven by an 呢玩EF1A promoter.
VB231214-1652bpz	pPB[Exp]-Hb9>CreERT2	A PiggyBac transposon 章但gene expression vector encoding a但日 tamoxifen-inducible recombinase un南內der the control of a mo歌校tor neuron-specific promoter.
VB010000-9365tax	pRP[Exp]-mCherry-CAG&短冷gt;hyPBase	A mammalian gene expression ve刀一ctor encoding PiggyBac transposase (P少務Base) as well as an mCherry r人計eporter.

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