哺乳動物基因LSL條件性表達載體

概述

常規質粒基因表達載體系統利用LoxP-Stop-LoxP（件愛LSL）表達盒，在哺乳動物細胞和動物體内實現Cre介導的條件性基因激活表達。L些這SL表達盒包含三個重複的SV40師制 polyA，序列兩(liǎng)端爲LoxP位開用點。用戶選擇的啓動子位于LSL表達盒的上議黑遊，而用戶感興趣的基因位于其下遊。在Cre重組酶不存在的情況下路朋，該表達盒完全阻斷了目的基因的正常表達；當將(jiān白哥g)Cre引入攜帶該載體的細胞中時(shí)，目的基因上遊的問家LSL表達盒將(jiāng)會(huì)被(bèi)删路森除，從而目的基因能(néng)夠在用戶選擇的啓動站人子下被(bèi)永久激活表達。

該載體不僅适用于體外細胞培養，秒和更适用于轉基因動物模型的構建。當雨為攜帶這(zhè)種(zhǒng)載體的轉基因動物與攜帶組織特異性關討表達Cre的轉基因動物雜交時(shí)，産行去生的動物後(hòu)代將(jiāng)在特定新子的細胞中組織特異性表達Cre，從而啓動目的基因在該特定細胞中組織特異性表達愛慢。

在細胞培養中使用該載體系統時(shí)，可將(jiāng)抗生素或城行熒光标記添加到載體中，使轉染後(hòu)的細胞可被(bèi)篩選或可示蹤以便于會車分離出已永久整合載體的細胞。

關于該載體系統和Cre介導重組的更多信息，請參拿靜考以下文獻。

參考文獻	主題
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亮點

該載體是爲在哺乳動物細胞和動物體内實現Cre介導的條件性基因表達吃小而設計的。目的基因的表達最初是沉默的近快，但通過(guò)與Cre重組酶的共表達後(hòu)，目的基因上遊的3x 哥能SV40 pA將(jiāng)會(huì)删除，從而目的基請去因能(néng)夠在用戶選擇的啓動子下被(bèi)永久激活表達。

優勢

基因的穩定激活：經(jīng)過(guò)Cre重組酶處理後(hòu)，阻斷下遊基因轉錄為廠的3x SV40 pA將(jiāng)被(b雜紅èi)永久删除，随後(hòu)客戶選擇的啓動子能(n多制éng)夠驅動的目的基因的正常表達。

技術簡單：常規轉染即可把質粒轉入細胞，相比起(qǐ)病毒載體需要進(jìn)行病亮唱毒包裝，過(guò)程更簡單。

載體容量非常大：我們的載體總容量可達30 kb，錢城其中質粒骨架隻占3 kb，有足夠大的容量可以放置客戶所感興趣的序列。

高水平表達：常規質粒轉染細胞後(hòu)，可以産生非常高的拷貝數（每個細胞林裡多達幾千拷貝），使外源基因能(né和錢ng)高水平表達。

适用于體内應用：該載體不僅擁有良好(hǎo)的物你體外細胞轉導能(néng)力，更适用于體内活體動物實驗，如Cre介導的條件性基服分因表達轉基因動物。

不足之處

載體DNA非整合型：常規質粒在細胞裡(lǐ)主要以遊離DNA狀态存在，所以常規質粒轉染也稱爲瞬時(如舞shí)轉染。然而，質粒DNA也可訊一以以非常低的概率永久整合到宿主基因組中（質粒轉染哥說每10²~10⁶個細胞可能(néng)會(huì)有一個細胞的基因組被(bèi)整合，整合效率愛廠取決于細胞類型）。如果將(jiāng)攜帶了藥物抗性習畫基因或者熒光标記基因的載體轉到細胞中，在經(jī些術ng)過(guò)擴大和傳代培養後(hòu)場船，可以使用藥物篩選或細胞分選來還歌獲得穩定整合了該載體的細胞。

可轉染的細胞類型受限：不同類型細胞的質粒轉染效率差異很大。東分非分裂細胞比分裂細胞更難轉染，原代細胞比永生化細胞系更難轉染。一些重要你慢的細胞類型更是難以轉染，如神經(jīng)元和胰島β細胞。另外，什男質粒轉染局限于體外細胞實驗，很少運用到活體實驗。

基因拷貝數在不同細胞中呈現差異性：盡管成(chéng)功的轉染可以在單個細胞裡去了(lǐ)産生非常高的拷貝數，但不同細胞間子家卻有高度的差異性。在一些細胞中，質粒拷貝數你作非常高，而在另外一些細胞卻是低拷貝甚至沒(mé了近i)有。而病毒轉導更傾向(xiàng)于相對(duì)均這看勻地把基因轉到細胞中。

載體關鍵元件

Promoter: The promoter that 少來will drive expression of your gene of 輛畫interest after treatment 章嗎with Cre recombinase.

LoxP: Recombination site fo在黑r Cre recombinase. Whe校的n Cre is present the region flanked by畫湖 the two LoxP sites will be excised.

3x SV40 pA: Three repeats of the simian說短 virus 40 late polyadenyl路線ation signal. This te光讀rminates transcription fr熱小om the upstream promote鐘了r, preventing expression店低 of the downstream gene of interest場業.

Kozak: Kozak consensus sequence. It is p外動laced in front of the s樹信tart codon of the ORF of interes森麗t because it is belie對低ved to facilitate tran有也slation initiation笑高 in eukaryotes.

ORF: The open readin對的g frame of your gene of i微空nterest is placed here.

SV40 late pA: Simian virus 40 late polyadenylatio刀廠n signal. It facili歌司tates transcripti一黃onal termination of the upstream ORF城樂.

CMV promoter: Human cytomegalovirus immediate earl船那y promoter. It dri她文ves the ubiquitous expression of花就 the downstream ma生紙rker gene.

Marker: A drug selection gene (s拍月uch as neomycin resistance), a vi街近sually detectable gene (such 見司as EGFP), or a dual-reporter ge月不ne (such as EGF坐農P/Neo). This allows cel東新ls transduced with the vecto自吧r to be selected and/or visualized.

BGH pA: Bovine growth hor他微mone polyadenylation si影玩gnal. It facilitates transcription飛和al termination of the u訊和pstream ORF.

pUC ori: pUC origin of replic船木ation. Plasmids carrying t新可his origin exist in high copy number章術s in E. coli.

Ampicillin: Ampicillin resistance她體 gene. It allows th秒廠e plasmid to be maintained by ampicill拍媽in selection in E. coli.

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