哺乳動物基因Tet-On誘導表達質粒載體說唱（Low leak）

概述

Tet-On誘導型基因表達系統是控制哺乳動物細胞中目的基因定時(shí)議銀表達的強大工具。Tet-On誘導型基因表達載體作用：當不存在樹雨四環素及其類似物（如doxycycline）的情況下，請文目的基因幾乎或完全沉默；當往體系中添加四環鐵美素或其他類似物（如doxycycline）時(shí)，目的基因得到匠子快速高水平表達。四環素不存在的情況下時(s師拿hí)，衍生于TeR（Tet抑水能制蛋白）和KRAB-AB（Kid-1蛋白轉錄抑制黑微結構域）的融合蛋白tTS結合TRE啓動子，導緻基因轉錄抑制。另呢筆一方面(miàn)，四環素存在時(shí)，衍生于突變型Ter抑制蛋白和關討VP16蛋白（轉錄激活結構域）的融合蛋白rtTA結合TRE啓動子，激活基因轉錄得音。

除了以tTS和rtTA融合蛋白作爲基因轉錄激活的開(kāi)關的标準Tet-On載體系統，我們還(hái)提供專門爲組織特異表達設計低洩露型（Low leak）體地Tet-On載體系統。這(zhè)種(zhǒng)實驗通常要求在靶組現作織處四環素存在，而非靶組織處無四環素說歌作用。該載體上存在三個表達盒：1. TRE啓動子驅唱關動的GOI表達；2. 通用啓動子驅動的tTS基因表達；3. 用戶自定義師電啓動子驅動的rtTA基因表達。當四環素不存在時(shí)，通用啓動子驅答美動tTS在所有組織中表達。tTS結合TRE啓動子，導緻GOI在所有組織年森中的轉錄抑制。四環素存在時(shí)，rtTA被(bèi)在靶組織被(b場東èi)轉錄并結合TRE啓動子，從而激近街活GOI在靶組織中表達。

常規Tet-On質粒載體可以用質粒轉染的方式如如導入多種(zhǒng)多樣(yàng)的哺乳動海子物細胞。在生物醫學(xué)領域，利用常規轉染將(章科jiāng)質粒載體轉到哺乳動物細胞中是使友年用最廣泛的方法。雖然近年來開(kāi)發(熱呢fā)了不少更爲先進(jìn)的基因導入慢小載體系統（如慢病毒載體、腺病毒如錢載體、AAV載體和piggyBac等報藍），但常規質粒基因表達載體仍被(bèi)大多數實驗室使用，這(朋藍zhè)主要得益于其在技術上的是子簡便性以及在各種(zhǒng)類型細胞中的高效轉染率。常規質裡視粒載體轉染的關鍵特點是短暫性，并且在宿坐少主基因組中的整合效率非常低（通可自常小于1%）。

關于該載體系統的更多信息，請參考以下文獻。

參考文獻	主題
Science. 286:1766 (1995)	Development of rtTA.
J Gene Med. 1:4 (1999)	Development of tTS
Semin Cell Dev Biol. 13:121 (2002)	Review on Tet-based syst很水ems

亮點

我們的Tet-On誘導型基因表達載體旨在—妹行當缺乏四環素時(shí)，實現目的基因的幾乎或完全分間沉默；當往體系中添加四環素時(shí)，目的請如基因得到快速高水平表達。Low leak型Tet-On載體系統是一藍靜種(zhǒng)改進(jìn)版本，可以讓目的基因在四環友遠素存在的情況下于靶組織特異表達，而在非靶組織減少其員笑表達至極低水平。我們的載體系統已經(jīng)過(guò)優化，其在大腸杆些下菌中具有高拷貝複制能(néng)力，且對(duì)舊城細胞具有高效轉染率。

優勢

類似開(kāi)關的嚴格基因表達調控：隻依賴rtTA的Tet-on系統在沒(mé科看i)有誘導劑的情況下，會(huì)有明顯的洩露表達。我們的T會話et-On基因表達載體可嚴格調控基因的表達，在沒(méi)有誘導劑的情況下可雨金將(jiāng)背景洩露表達最小化，并保持該系統對(duì)四環素誘導草習的高靈敏度。

在非靶組織最小化洩露表達：我們的Low leak版本Tet-On載體系統整麗章合有CBh啓動子驅動tTS表達。無四環素作用時(shí)，非愛地靶組織區域的tTS結合TRE啓動子，抑制有裡了目的基因的轉錄表達。

載體容量非常大：我們的載體總容量可達30 kb，其中質粒骨架和Te和森t-On元件隻占5.2kb，有足夠大的容量可以放置客戶所感興趣的序列。得物

高水平表達：TRE啓動子可驅動目标基因在誘導狀态下高水平表達。另外，常事著規質粒轉染細胞後(hòu)，可以産生非常高的拷貝數（每個細胞多達幾千拷個友貝），使外源基因能(néng)高水平表達。

不足之處

載體DNA非整合型：常規質粒在細胞裡(lǐ)主要以頻離遊離DNA狀态存在，所以常規質粒轉染兵北也稱爲瞬時(shí)轉染。然而，質粒DNA也可以以非短弟常低的概率永久整合到宿主基因組中（質粒轉染每10²~10⁶個細胞可能(néng)會(huì)也紙有一個細胞的基因組被(bèi)整合，整合效率取雜聽決于細胞類型）。如果將(jiāng)攜帶了藥物抗性基因或者熒光标記基因的載體轉路通到細胞中，在經(jīng)過(guò)擴大和傳代培養後(hòu)，可來低以使用藥物篩選或細胞分選來獲得穩定整合了該載體的細胞。

可轉染的細胞類型受限：不同類型細胞的質粒轉染效率差異很大。非分裂細胞比分裂細胞更難轉裡個染，原代細胞比永生化細胞系更難轉染。一些重要的細胞類型更是難以轉染，如神經(j話照īng)元和胰島β細胞。另外，質粒轉染局限于下見體外細胞實驗，很少運用到活體實驗。

基因拷貝數在不同細胞中呈現差異性：盡管成(chéng)功的轉染可以在單個細胞裡(lǐ)産生非器微常高的拷貝數，但不同細胞間卻有高度的差異性。在一些細胞中，唱睡質粒拷貝數非常高，而在另外一些細胞卻是低拷貝甚至沒(méi)有。而病毒轉導和數更傾向(xiàng)于相對(duì)均勻地答光把基因轉到細胞中。

載體關鍵元件

TRE promoter: Tetracycline-responsive element promote制黑r (2nd generation). This elemen北文t can be regulated by a 上房class of transcriptio遠快n factors (e.g. tTA, rtTA and 聽愛tTS) whose activities are dependent 呢知on tetracycline or 民動its analogs (e.g. doxycycline).

Kozak: Kozak consensus s頻話equence. It is pla玩睡ced in front of the start codon o分數f the ORF of interest to facilitate tr月月anslation initiation 男爸in eukaryotes.

ORF: The open readi紙頻ng frame of your gene 東湖of interest is placed女數 here.

rBG pA: Rabbit beta-globin polyadenylati外們on signal. It facilitates transcri土紙ptional termination of t務玩he upstream ORF.

Promoter: The tissue雜農-specific promoter chosen to driv見綠e expression of the和什 rtTA protein.

rtTA: Reverse tetracy他分cline responsive tran會內scriptional activator M2 (2nd gen頻技eration). This protein binds to TRE pr從他omoter to activat這去e gene transcription on費線ly in the presenc海海e of tetracycline or its analogs (又白e.g. doxycycline). It ha多又s higher sensiti湖文vity to the inducing drug and資唱 lower leaky activity in the abs愛線ence of the drug compared to its prede子視cessor.

SV40 late pA: Simian virus 40 late polyadenylatio票雪n signal. It facil購師itates transcriptional terminati問習on of the upstream rtTA 美聽protein.

CBh promoter: CMV early enhancer fused to相房 modified chicken β-actin promoter. T電生his drives the expression of th湖區e downstream tTS protei刀時n.

tTS: Tetracycline-control時哥led transcriptional silencer. This p雪務rotein binds to TRE promoter to active樹城ly suppress gene transcription only樂你 in the absence of tetrac服那ycline and its analogs (e.g. doxycyc照和line).

SV40 late pA: Simian virus 40 late polyad作醫enylation signal.腦林 It facilitates transcriptional term友子ination of the upstream tTS protein我人.

Ampicillin: Ampicillin店藍 resistance gene. It allows the影拿 plasmid to be maintain雪玩ed by ampicillin selection in E. coli.

pUC ori: pUC origin of replication筆電. Plasmids carrying 輛聽this origin exist 也爸in high copy numbers in E. co校西li.

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