AAV衣殼定向(xiàng)進(jìn)化

重組AAV病毒由于其多樣(yàng)的組織嗜性、長(cháng)畫水時(shí)間的轉基因表達效果、非緻病性以及低免疫原國窗性等特點，作爲一種(zhǒng)基因遞送載體被(bèi)廣泛用于基因治生小療和疫苗開(kāi)發(fā)。

既有的AAV血清型存在一定的問題影響了其用于基因治療的潛力。首先，盡管書很現有的血清型提供了一系列組織嗜性以供選為機擇，但是在臨床應用上仍然具有一些類型的組織是這(zh拿信è)些血清型的特異性無法覆蓋的。第二，師這盡管一些特定血清型的AAV可特異感染靶組織，但是其小海基因遞送效率可能(néng)偏低，或者具有脫靶效應感染其他組織。第科樹三，體内預先存在針對(duì)多種(zhǒng)AAV事票血清型的中和抗體將(jiāng)從一開(kāi)始或者文媽多次給藥後(hòu)阻礙AAV的感染。最後(hòu)，一些AAV血離謝清型類型相比其它類型更難在生産中獲得高做大的滴度、純度和穩定性。爲克服這(zhè)些問題，AAV衣殼開(kāi)發子但(fā)在加速獲得新型AAV突變體、改善AAV性能(néng)方面(mi生雪àn)一直是相當重要的技術。

定向(xiàng)進(jìn)化是一種(zhǒ長花ng)常用于提高生物大分子性能(néng)的高通量方法。該方法模拟自然選擇過(冷小guò)程并將(jiāng)其所耗時(shí)間大幅縮短。A朋舊AV衣殼定向(xiàng)進(jìn)化通音湖過(guò)突變野生型AAV衣他南殼基因，獲得具備高度多樣(yàng)性的AAV衣殼文庫，然後(hòu)從中都有篩選出全新的、性能(néng)更優越的AAV衣遠謝殼。由于定向(xiàng)進(jìn)化不需要具備技木蛋白結構與功能(néng)相關的先驗知識，拿外因此在新型AAV衣殼開(kāi)發(fā)上相是厭對(duì)于理論設計方式更具優勢。

如何獲取AAV衣殼定向(xiàng)進(jìn)化CRO服務？

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服務亮點

• 全方面(miàn)的服務平台：載體家是當前全球唯一一家具備AAV臨床前、臨靜雨床CRO和CDMO一站式服務的企業討這。我們的AAV相關服務涵蓋載體設計、載體優化、載體克兵藍隆、文庫構建、病毒包裝、衣殼定向(xiàng)進一這(jìn)化和工程改造、AAV組織分布鑒定、GMP病毒生産等。
• 多策略定向(xiàng)進(jì在友n)化構建衣殼高度多樣(yàng)性的病毒文庫：我們在文庫構建方面(miàn)的豐富經(jīng現會)驗，可以幫助您通過(guò)定向船通(xiàng)進(jìn)化以及其腦會結合方法進(jìn)行自定義設計，以獲得極具醫來病毒衣殼多樣(yàng)性的文線友庫。
• 文庫病毒高滴度包裝：我們可使用一步法或兩(liǎn朋月g)步法包裝文庫病毒，并保證每種(zhǒng)少票衣殼或基因組發(fā)生突變的病毒均具有很高的滴度。
• 使用包括非人靈長(cháng)類（Non-human p間草rimate，NHP）在内的多種(zhǒ雨讀ng)模式生物進(jìn)行體内篩選：除了進(jìn)行體外篩選，我們還(hái)提供一系列水生模式生物用于進(jìn)行體内篩選，如小鼠、大鼠、以及重要的兩(liǎng輛機)種(zhǒng)非人靈長(cháng)類：食蟹猴（Macaca f時市ascicularis）和猕猴開快（Macaca Mulatta）。所有體内篩選試驗均在經(jīng)算師過(guò)AAALAC認證的機構中以專業認可的方式進(j雪鐘ìn)行。
• 完善的技術支持：我們的科學(xué)家在AAV劇子衣殼開(kāi)發(fā)項目上具有深厚的經(jīng)驗做購，能(néng)夠爲您提供全面(miàn)的技術支持，包括從文庫設計、文路文庫構建到體内篩選以及NGS分析。

衣殼進(jìn)化和篩選流程

實施AAV衣殼定向(xiàng)進(jìn)化的懂民第一步也是最關鍵一步是制備高度多樣(yàng)性的AAV轉移外件載體文庫，每個載體上包含一個嵌合型AAV基因組路公：含有一個rep基因和一個突變cap基因。現今已有多間月種(zhǒng)方式可以高效制備這話公(zhè)種(zhǒng)突變cap基因，比如易錯PCR（Er門雪ror-prone PCR）、随機哥謝多肽展示（Random peptide display是關）、家族DNA洗牌（DNA family shuffling）、以及計算她高機設計（In silico design）等。轉移載體被(bèi)包裝成(歌房chéng)病毒顆粒，每個病毒顆粒的基因有制組包含一個突變cap基因。文庫中這務好(zhè)些混雜的嵌合型病毒随後(hòu)計員被(bèi)篩選并測試以下方面(miàn)：一、高效轉導特定組織或器官的靶短呢細胞；二、高度親和細胞特異性表面(miàn)受體；三、能(néng)夠鐘是逃避中和抗體。經(jīng)過(guò)篩選後(hòu)城電的的病毒基因組從靶細胞中複原，然後(hò員書u)被(bèi)用于構建一個新的更小的文庫用于第要美二輪篩選，并在多個篩選周期後(hòu)得到某種(zhǒng)富集地明的突變型衣殼。該基因克隆經(jīng)過(guò)驗證即認爲發(f喝筆ā)現了一種(zhǒng)新型的具有更強性能(néng)的變異AAV衣殼頻光（圖1）。

圖1 AAV衣殼定向(xiàn麗知g)進(jìn)化的典型篩選流程

定向(xiàng)進(jìn)化構建衣殼文庫

以下策略常用于制備突變型AAV請對衣殼。用于篩選的衣殼文庫通過(g線廠uò)大規模并行克隆AAV載體獲得。這(zhè)些載體均包含了嵌火說合型的AAV基因組（每個載體包含一個rep基因和一樹時個突變cap基因）。

易錯PCR

易錯PCR是最直接用于開(kāi)發(fā)高度多樣(yàng)呢讀化的AAV衣殼的選擇，這(zhè)其中包括從修改标準PCR方法到突變AAV衣明熱殼基因等多種(zhǒng)方式。更具體而言，易我民錯PCR結合了多種(zhǒng)次優化的PCR條件，如使用低保真性聚合酶、更銀資長(cháng)的延伸時(shí)間、更高的Mg化東²⁺濃度、添加Mn²⁺，以及使用不相等的多種(zhǒng)dNTP濃度等方式來對(duì)AAV衣殼如校基因引入随機突變。

随機多肽展示

随機多肽展示通常使用7到9個随機多肽序列插入城離到AAV衣殼蛋白序列的特定位點，以達到改變病毒與特定細胞表面(miàn)受體的笑謝天然相互作用的目的。插入的多肽一般位于AAV衣人空殼暴露此段多肽的位置或者介導病毒與細胞相互作用的關鍵位置。例如，AAV2衣殼工章蛋白的587位到588位氨基酸（位于VRIII可變區山可）是一個适用于AAV2多肽展示文庫的插入位點。在此位點插路用入多肽可以阻礙與AAV2作用的硫酸類肝素多糖蛋白（Heparan s錯道ulfate proteoglycan, HSPG）模體的功能(néng)（謝輛HSPG是識别AAV2的主要細胞表面(miàn)受體），并促進(jìn)展示的多美多肽與細胞表面(miàn)分子相互作用。

家族DNA洗牌

家族DNA洗牌是一種(zhǒng)通過(guò)妹你不同AAV血清型的親本衣殼基因筆美分子雜交産生嵌合AAV衣殼的高船區效方法。爲了實現這(zhè)一點，將(這些jiāng)不同AAV血清型的親本衣殼基因碎片化，然後(秒月hòu)通過(guò)無引物PCR利用部分序列同源性將(ji靜少āng)其重組爲新型AAV衣殼。作爲一種(zhǒ雪草ng)替代策略，還(hái)可以通過(guò)綜合跳人洗牌法與其他設計方法創建高複雜性的文庫，即將(jiāng)理論設計科時（基于AAV生物學(xué)的先驗知識修改衣殼序列）與定向(xià子做ng)進(jìn)化相結合。在這(zhè)種(街技zhǒng)方法中，爲發(fā)現和評估适合進(jìn)行下熱突變的衣殼位點，將(jiāng)首先對(du志明ì)天然血清型的AAV衣殼的精細結構和序列進(jìn)行分析。這(zhè藍空)些含有突變的基因碎片最後(hòu)唱很將(jiāng)合成(chéng)爲全長(cháng)序列，并用于市器組裝新型AAV衣殼。

計算機設計

現今已有多種(zhǒng)計算機方法可用于預測朋醫促使AAV性能(néng)得到加強的衣殼序列。其中一的兵個常用的方法是祖先衣殼重建，涉及多個計算著通機設計的祖先AAV衣殼文庫的構建，然後(hòu雪微)進(jìn)行實驗驗證以發(fā)現組織嗜性得到改進(jìn)的衣殼序列去分。該方法背後(hòu)的機理在于經(jīng)自然民草選擇留下的AAV進(jìn)化中間體大概率上見他已演化出獨特的性狀，并且仍然能(néng)維持病毒的結構和功的慢能(néng)。另一方面(miàn)，機器學(xué)習則是體是另一種(zhǒng)廣泛使用的計算機設計方法計子，根據輸入的大量蛋白質結構與功能(néng船姐)的關系數據來預測新型AAV病毒金答衣殼的組裝。

衣殼文庫的病毒包裝

衣殼文庫的病毒包裝可以劃分爲一步法或者兩(liǎng)步法，如下問新所述：

一步法包裝衣殼文庫

包裝AAV衣殼文庫的傳統方法是采用一會數步法：衣殼文庫和腺病毒輔助質粒共轉染包裝細胞。雖然這(zhè)種畫業(zhǒng)方法被(bèi)廣泛使用，但它确下如實存在交叉包裝（具備衣殼變異體的AA錢劇V顆粒其基因組和衣殼類型不匹配）和衣殼鑲嵌（AAV的衣殼組分來源于理藍多種(zhǒng)變異體）的缺點。爲了克服這(zhè)些問題，建議以極低的慢間文庫質粒數/細胞數比率轉染包裝細胞，以确保每個細胞至多吸收一個文庫質粒。

兩(liǎng)步法包裝衣殼文庫

在兩(liǎng)步法包裝中，衣殼文庫首先又務與編碼野生型衣殼基因但缺少病毒ITR的輔助質粒共轉染至包裝細多購胞中。這(zhè)將(jiāng)産生帶有鑲嵌型衣殼的AAV顆粒，這(zh低她è)種(zhǒng)部分由野生型VP蛋白組志男成(chéng)的衣殼被(bèi短很)稱爲AAV轉移穿梭機（AAV transfer shuttle）。將舞金(jiāng)此種(zhǒng)AAV以低感染複數轉導包裝相事細胞，以實現每個細胞至多感染一個病毒顆粒。随後(hòu)用野生型腺病毒懂哥對(duì)包裝細胞進(jìn)行雙重感拍刀染，最終産生高滴度病毒衣殼文庫。

體外與體内文庫篩選

爲獲得帶有期望性狀的嵌合型AAV，根據篩選目訊冷的病毒衣殼文庫通常需要經(jīng)過(gu地明ò)在體外或者體内的多次篩選：

體外篩選

利用已建立的細胞系篩選AAV衣殼文庫是一種(zhǒng)常用的體電城外篩選方法，特别是用于發(fā)現靶向(x拍錯iàng)受體能(néng)力發(f雨車ā)生變化的衣殼突變型AAV。AAV文庫的體外篩選快速且技錯短術簡單，但是也存在一定的問題。首先，針對(duì)體外高轉導效率優件得化的載體在體内使用時(shí)可能機自(néng)無法重現相同的效率。其次，在體外表現出對我朋(duì)靶細胞高度特異性的AAV載體在體内時(少弟shí)可能(néng)會(huì)轉導非靶組織。體外篩場作選AAV文庫的另一種(zhǒng)農小策略是在感染靶細胞之前，將(jiāng數技)AAV文庫加入免疫動物的強效血清中以辨别具有免門個疫逃避屬性的突變型衣殼。然而，在體内實驗時(shí)衣殼突變的草大AAV引發(fā)免疫反應類型可能(néng)并不一緻（即使同樣(yàng湖火)的AAV載體，通過(guò)不同途徑輸送弟吧也可能(néng)會(huì)産生不同的免疫反應）。

體内篩選

體内動物模型爲篩選AAV文庫提供了更可靠的平台，特别是用于尋外拿找那些需要轉導體外難以培養的細胞的或者需要轉導複雜組織結構弟著中的特定細胞的AAV突變體。體内篩選還(hái)有助于發(fā)現與A自水AV突變體相關的任何的潛在脫靶效應。小鼠和NHP均廣泛長火用于AAV文庫的體内篩選，但是NHP模型由于與人類的高大鐘度相似，因此是篩選與臨床應用相關的改良型AAV載體的最佳平台。喝人