哺乳動物shRNA幹擾腺病毒載體

概述

腺病毒shRNA幹擾載體系統是電喝一種(zhǒng)可在多種(zhǒng)哺乳動物細通服胞中穩定幹擾靶基因表達的高效方法。該載體不會(huì)整著學合到宿主細胞的基因組中，而是以遊離DNA形式存在。該系輛飛統是體内應用測試的優先使用方法。

腺病毒載體來源于誘發(fā)普通感冒的腺病毒，野生型腺生慢病毒基因組是線性雙鏈DNA。

腺病毒重組載體構建完成(chéng)後(hòu)轉染進讀報(jìn)入包裝細胞。在包裝過(guò)程中，位于兩(liǎng)個反向(xi現對àng)重複序列（ITRs）之間的DNA片段與由包裝資空細胞表達的病毒蛋白進(jìn)一步包裝成(ch店草éng)病毒顆粒。

當病毒轉導宿主細胞時(shí)，兩(liǎng)個ITR頻拿之間的外源DNA及病毒基因組一起(qǐ)進(jì城裡n)入細胞，并以遊離DNA的形式存在于細胞核中。由人類U6啓動子驅動表達和線的shRNA將(jiāng)會(huì)導緻靶基因mRNA的降解。

通過(guò)改造優化，我們的腺病毒載體缺失了E1A、E1B和E3區，前兩(下車liǎng)者與病毒包裝相關（這(zhè)兩(liǎng)個基因已被(體數bèi)整合到包裝細胞的基因組中）。因此，運用我們的病毒載體業黑包裝出來的病毒是複制缺陷型的（隻能(néng)轉導靶細胞而不能(néng)愛醫自我複制），大大提高了生物安全性。

關于該載體系統的更多信息，請參考以下文獻。

參考文獻	主題
Proc Natl Acad 討森Sci U S A. 91:8802 (1994)	The 2nd generation adenovi機雨rus vectors
J Gen Virol. 36:59 (1977)	A packaging cell 司工line for adenovirus vectors
J Virol. 79:5437 (2005)	Replication-competent adenovirus拍體 (RCA) formation in 293 Cells
Gene Ther. 3:75 還土(1996)	A cell line for te火筆sting RCA

亮點

我們的載體來源于血清5型腺病毒（煙森Ad5）。經(jīng)優化，該載體在大腸杆菌體内具有很高的拷貝數，包裝出來的見鐵病毒具有高滴度，能(néng)有效轉嗎林導靶細胞，實現外源基因的高水平表達。人類U6啓媽熱動子能(néng)夠驅動shRNA的高水音船平轉錄，同時(shí)，我們經(jīng)過(guò)優化的shRNA莖新自-環序列可高效形成(chéng)有效的幹擾RNA。

優勢

對(duì)宿主基因組造成(chéng)破壞的低風險性：在轉導進(jìn)入靶細胞後(hòu)，路短腺病毒載體在細胞核保持著(zhe)遊離DNA的狀态，可工書以降低宿主基因組被(bèi)破壞而緻癌的風險，使其成(c坐要héng)爲人類體内實驗的理想載體。

超高病毒滴度：腺病毒可通過(guò)再次轉導包裝細胞而林志得到大量擴增，從而獲得超高滴度病毒，慢病毒載體、逆轉錄病毒載體和AAV載輛業體都(dōu)不具有這(zhè)個特性。我們提供的腺病毒滴度可那熱以達到>10¹² VP/ml。

宿主範圍廣泛：來源于人、小鼠和大鼠等常用哺乳動物細胞都(dōu)能(né放劇ng)被(bèi)腺病毒載體轉導，但某些細胞類新北型則比較難轉導（見下文不足之處）。

體内外實驗均有效：我們的載體不僅能(néng)用于體内活體動物實驗，還(hái小多)具有體外細胞轉導能(néng)力。

安全性：爲了确保腺病毒載體的生物安全性，我們的腺病毒載體缺失了道唱病毒包裝所必須的基因（這(zhè)些基因被(bèi)整合到包慢日裝細胞的基因組）。所以，利用我們的腺病毒載體包裝出來的病毒短謝是複制缺陷型的，并且隻有在包裝細胞中才具有複制能(néng)力。月站

不足之處

載體DNA非整合型：腺病毒基因組不會(huì)整合到靶細胞的基因組中時信，而是以遊離DNA的形式存在，并且随著(zhe)時(shí)間員票推移逐漸丢失，特别是在分裂細胞中。答不

難以轉導特定類型的細胞：雖然我們的腺病毒載體可以轉導很多類型的房行細胞包括非分裂細胞，但對(du樂快ì)某些特定類型的細胞如内皮細胞、平滑肌細胞、線問呼吸上皮分化細胞、外周血細胞、神經(jīng)元和造血幹細胞等，卻無法進(jì近國n)行有效的轉導。

較強的免疫原性：活腺病毒會(huì)在動物體内引起(qǐ)強烈的免疫反應，從而限制紅呢了其在體内的某些應用。

技術複雜：使用腺病毒載體時(shí)，需要在包綠外裝細胞中産生活病毒，然後(hòu)測定病毒滴度。這(zhè)些過(guò)吃司程技術難度更高，周期更長(cháng)。

載體關鍵元件

5' ITR: 5' inverted terminal repeat雪能. In wild type virus, 5' ITR 船物and 3' ITR are essentiall畫物y identical in sequence. They 問冷reside on two ends of t弟房he viral genome pointi商快ng in opposite directions, where th師唱ey serve as the origin o不信f viral genome replication.

Ψ: Adenovirus packagin答吃g signal required fo化讀r the packaging of兒內 viral DNA i妹照nto virus.

U6 Promoter: Drives expression 子那of the shRNA. This is the promoter o匠風f the human U6 snRNA gene, an RNA p間拍olymerase III promoter which 媽畫efficiently expresses short RNAs.

Sense, Antisense:離生 These sequence跳著s are derived fro照們m your target sequences, and are t暗到ranscribed to form the st請拿em portion of the “hairp黑關in” structure of the sh公拿RNA.

Loop: This optimized sequence is tra員們nscribed to form the loop portion自那 of the shRNA “hairpin” st術會ructure.

Terminator: Terminates trans我又cription of the shRNA.

hPGK promoter: Human phosphogl紅問ycerate kinase 1 gene promoter. It d舞木rives the ubiquitous expression of the 問什downstream marker gene土花.

Marker: A drug selection gene (such as neomyci錢員n resistance), a visually detec拿有table gene (such as EGFP), or a du數員al-reporter gene (such as EGF這頻P/Neo). This allows ce道那lls transduced with the問討 vector to be selected and/or visual美睡ized.

SV40 late pA: Simian virus 40 la機什te polyadenylatio玩是n signal. It facilitates transcr現喝iptional termination of the腦章 upstream ORF.

ΔAd5: Portion of Ad5 genome b來工etween the two ITRs minus 家就the E1A, E1B and E3 regions.

3' ITR: 3' inverted terminal repeat. 相月See description for 5’ ITR.

pBR322 ori: pBR322 ori北弟gin of replication. Pl道得asmids carrying thi筆草s origin exist in 爸明medium copy numbers in E. coli.

Ampicillin: Ampicillin resist司船ance gene. It allows the plasmid to房自 be maintained by ampici姐會llin selection i章近n E. coli.

PacI: PacI restriction site (地學PacI is a rare 秒水cutter that cuts at TTAATTAA). 舞弟The two PacI restric老新tion sites on the vect坐靜or can be used to lineariz歌廠e the vector and remove the vect我數or backbone from the viral 低商sequence, which is ne喝靜cessary for efficient pac通風kaging.

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