哺乳動物基因表達Tol2載體

我們的Tol2載體系統能(néng)高效地將(jiāng)外源DNA綠影插入宿主細胞基因組中。該系統技術簡單，利用質粒轉用喝染（非病毒轉導）將(jiāng)目的基因永久整合到宿主基因組中。

該系統來源于Tol2轉座子，它最初是從硬骨魚青鳉魚（Or近為yzias latipes）中分離出來的。 基于序列同源性分析，發(f也綠ā)現Tol2轉座子與整個脊椎動物基因組中發(暗志fā)現的非自主元件的hAT家族密切相關。

Tol2系統包含兩(liǎng)算窗個載體，一個載體被(bèi)稱人地爲輔助質粒，負責編碼轉座酶；另一個載體被(bèi)稱爲轉座子質低土粒，包含兩(liǎng)個反向(xiàng)末端重複序列（ITRs）以及兩(l信相iǎng)者之間的轉座區域，需要被(bèi)轉座市答到宿主基因組中的目的基因就(jiù)克隆在這(zhè)個區域。

Tol2系統包含兩(liǎng)個組分，一個組分是Tol2轉雨喝座酶（通常爲表達Tol2轉座酶的IVT mRNA）。另一個組分爲轉座子載體，包對在含兩(liǎng)個反向(xiàng)末端重複序列（ITR作體）以及兩(liǎng)者之間的轉座區內多域，需要被(bèi)轉座到宿主基因組中的目的基因就(j明鄉iù)克隆在這(zhè)個區域。

表達Tol2轉座酶的IVT mRNA和動呢轉座子載體共轉染至靶細胞時(shí)，IVT mRNA産生的轉座酶將(jiān間理g)會(huì)識别轉座子的兩(liǎng)個I匠女TR，然後(hòu)將(jiāng)被(bèi)轉座區對個和兩(liǎng)個ITR元件插入到宿主基因組中。Tol2書問轉座子在宿主細胞中的插入位點沒(méi)有明顯堿基偏好(hǎo)性，這(z錯她hè)不同于具有特定靶标位點的轉座子系統。如，piggyBac轉座插入通常發問我(fā)生在包含TTAA序列的宿場吧主染色體位點。

Tol2是II類轉座子，通過(guò)“剪切—粘貼”的機制移動，從一個地方很土轉座到另一個地方，而不留下序列本身（恰好(hǎo)多什相反，I類轉座子是通過(guò)“複制—粘貼”的方式移動）。Tol2海農通過(guò)“剪切-粘貼”機媽地制以單拷貝進(jìn)行整合，在每一個插入位點都(dōu)會(huì)産生一雪中個8 bp的重複序列。

有兩(liǎng)種(zhǒng)們樹途徑可將(jiāng)轉座酶導入靶細胞。第風錢一種(zhǒng)是將(jiāng)輔助質粒瞬時(shí)轉染到細胞中，使轉地裡座酶的瞬時(shí)表達。 第二種(zhǒng)是利用輔助質粒體外轉錄出T校麗ol2 mRNA，然後(hòu)注射到靶細胞中。無論哪種(zhǒng)情況，能用轉座酶都(dōu)隻能(néng)短時(shí)間表達。 随著(zhe)輔那問助質粒的丢失或轉座酶mRNA的降解，轉座子會(huì)永久整合到宿短月主基因組中。如果將(jiāng)Tol2轉看音座酶重新導入細胞中，整合的轉座子鐘影會(huì)再次通過(guò)“剪切—粘貼”的畫子機制移動。

關于該載體系統的更多資料，請參考以下大們文獻。

外源基因的永久整合：常規質粒轉染隻能(néng)實現外源基因的瞬時(shí)表達，這(數玩zhè)種(zhǒng)外源基因火人會(huì)随著(zhe)宿主細胞的分裂而不斷丢失，在快速分裂的唱電細胞中顯得尤爲顯著。相反，將(jiāng議區)Tol2轉座子載體和輔助質粒（就算或者Tol2 mRNA）一起(qǐ)轉染到哺乳動物細胞中，由于轉座化電子在轉座酶的作用下，目的基因能(néng)穩定匠森地整合到宿主細胞的染色體中，從而實現轉座子載體上攜帶的目的厭行基因在宿主細胞中永久表達。

技術簡單：通過(guò)常規轉染即可把質粒轉入細胞，相白銀比起(qǐ)病毒載體需要進(jìn)行病毒包裝，過(gu市計ò)程更簡單。

載體容量大：我們的轉座子載體總容量可達11 kb，其中質粒骨架隻占3 k書也b，有足夠大的容量可以放置客戶所感興草請趣的序列。

轉染細胞類型受限：Tol2載體進(jìn)入細胞依賴于轉染。不同類型的細胞些鄉，其轉染效率差異非常大。非分裂細胞從看通常比分裂細胞更難轉染，原代細胞比永生化細胞更唱裡難轉染，一些重要的細胞類型轉染難度更大，如神經(jīng)元和胰島β細胞。另外到道，質粒轉染主要局限于體外應用，很少應用新員于體内實驗（但可以應用于轉基因動物模型制備）。以上因素在一定程度上制約了T能音ol2系統的應用。