哺乳動物shRNA幹擾scAAV載體

通俗名稱：scAAV shRNA幹擾載體，scAAV shRNA knockdo風光wn vector

VB系統名稱：哺乳動物shRNA幹擾scAAV載體，mammalian shRNA年拍 knockdown scAAV vecto銀資r

我們的scAAV（self-complementary adeno快店-associated virus，中文名爲雙鏈腺相關門山病毒或者自我互補腺相關病毒）shRNA秒照幹擾載體系統是一種(zhǒng)有效敲低哺乳飛錯動物蛋白基因表達水平的工具，可用于體外培養細胞、動物體内實驗。嗎討

scAAV是基于ssAAV（adeno-associat人森ed virus，中文名爲腺相關病毒，簡唱外稱AAV或者ssAAV）改造而成(chéng)的一種(zhǒng)海東病毒基因組是自我互補型雙鏈DNA的AAV。由于野生型的AAV不讀的病毒基因組是single-stranded D些新NA，與scAAV區分時(shí區動)，往往寫成(chéng)ssA也身AV。ssAAV病毒顆粒感染細胞後(hòu)，必須借助宿主細胞的D議聽NA聚合酶複制出第二條鏈（second strand synt歌習hesis）後(hòu)才能(néng)成(chéng爸動)爲有轉錄功能(néng)的dsDNA（double-stranded車年 DNA，雙鏈DNA）。除了第二條鏈合雨弟成(chéng)途徑，多個ssAAV進(jìn)到細胞後(hòu)放山，部分正鏈基因組分子和負鏈基因組分子（plus- an電用d minus-stranded AAV 錯器;genomes）也能(néng)退火形成(c議弟héng)dsDNA。當AAV載體上國那的基因組長(cháng)度小于野生型AAV基因組長(cháng)度的一內厭半，包裝出的病毒顆粒也會(huì)出現含有二聚體形式的基因組（dimeri空通c genome），而不是單聚體基林煙因組（monomeric gen物國ome）。這(zhè)些病毒轉關子導細胞後(hòu)，二聚體形式的基因組自行退火形笑員成(chéng)dsDNA，從而繞過(guò數來)了第二條鏈合成(chéng)的這(zhè)一步限速離通步驟。爲了進(jìn)一步增加病毒二聚體基用現因組的量，我們將(jiāng)AAV載體的3’ ITR（Inverted數匠 terminal repeat）中的trs序師物列（terminal resolution s鐘能ite）删除。缺失了trs序列的3’ ITR討南使AAV載體在病毒包裝時(shí)能(néng)複制出一條空玩中央有一個突變型ITR而兩(liǎng)頻舊端是野生型ITR的，而左半序列與右半序列是反向開要(xiàng)重複的病毒基因組分子。感染細胞後(h唱吃òu)，反向(xiàng)重複的兩(liǎng)半序列通過(guò)兒請分子内堿基配對(duì)，最終這(zhè)條單鏈DNA能(néng)自我折視到疊形成(chéng)dsDNA。這(zhè)樣(yàng)的載體稱之爲s開拿cAAV載體。

圖1. ssAAV和scAAV基因組形成(習拿chéng)路徑

與其他常用病毒相比，腺相關病毒具有以下特點：

• 低免疫原性（low immunogenicity，AAV姐河在人類和其他靈長(cháng)類動物中非常普遍）
• 安全（strong safety到快 record，AAV對(duì)人類沒(méi)有緻病性）
• 結構簡單（simple structure，AAV是一層衣殼蛋白包數下裹著(zhe)一條4.7 kb長(c靜答háng)的單鏈DNA的二十面(miàn)體顆粒）
• 個頭小（small size，發器上(fā)現至今，最小的非包膜病毒）
• 相對(duì)穩定（high stability，與慢病毒嗎風相比，AAV看起(qǐ)來更像一個巨大的蛋白分子，M技離W= ~5,200,000，能(néng)耐受一定家爸範圍的pH、溫度、鹽濃度等環境變化）

故腺相關病毒載體是基因治療的理想工具，已被(b紙和èi)廣泛用于動物實驗和臨床試驗。

研究某個基因功能(néng)，往往從獲得基因功能(néng)（gai房北n of function）和缺失基因功能(nén弟低g)（loss of func行友tion）兩(liǎng)個方向(xiàng)設計實驗。雖然近年輛議湧現了CRISPR等新技術，shRNA幹擾技術依然是基因功能(né務化ng)缺失的熱門技術。與CRI愛兒SPR基因敲除不同，shRNA特異性打靶mRNA，不會(huì)改變靶關音細胞的基因組序列。與CRISPRi基因沉默不同很謝，shRNA能(néng)特異性筆就打靶一個基因的某一條mRNA。shRNA可校表達後(hòu)，被(bèi)加⼯成(chéng鐵腦)small interfering RNA（s電遠iRNA）。這(zhè)些siRNA與RNA-indu街麗ced silencing complex（RISC）機森結合，找到與siRNA的反向(xiàng)鏈完全互雨大補的mRNA分子，接著(zhe)剪切mRNA，從而抑制m放小RNA編碼的蛋白翻譯表達。

圖2. shRNA打靶機制

我們的scAAV shRNA幹擾載體在兩(liǎng)個門鄉ITR之間含有兩(liǎng)個基因表達盒子。上遊基因是Pol III啓動子驅科票動的shRNA表達盒子，而下遊基因哥事是Pol II啓動子驅動的熒光标記基因表達盒子。在哺乳動物細胞中，Pol 我房II RNA聚合酶一般轉錄mRNA序列，而small RN答樹A分子通常都(dōu)是Pol III R近市NA聚合酶負責轉錄的。shRNA序列通常隻有幾十開木bp，必須使用轉錄small RNA的Pol 微水III啓動子，如人U6啓動子。下紅刀遊marker基因則使Pol II啓動子，如CMV啓動子。A土木AV包裝時(shí)的ITR序列來源器問于AAV2，這(zhè)是一種(zhǒng)常用的AAV載體家都構建方式，不影響血清型。另一方面秒工(miàn)，決定血清型的衣殼蛋白基因由Rep/C爸湖ap包裝質粒編碼。

圖3. scAAV shRNA幹擾載體結構圖

從載體構建到病毒轉導的簡略流程：

1. 將(jiāng)shRNA序列插入骨架載體，構建成(chéng)最短們終載體後(hòu)，轉化到E. coli進(jìn)行質粒擴增。

2. 將(jiāng)轉移質粒（含有ITR序列的AAV載體）大年、Rep-cap質粒和adenoviral helper質粒一并轉染至書內包裝細胞（例如293T細胞），這(zh為的è)一步通常叫(jiào)triple trasnfection。在包裝細到綠胞裡(lǐ)，轉移載體負責病毒基因組DNA的複制，R秒動ep-cap質粒負責表達出Rep功能(néng)蛋白和Cap結構蛋分裡白，adenoviral helper質粒負責表達出輔助包裝的蛋白。此時(s務南hí)，scAAV shRNA幹擾載體醫冷上的兩(liǎng)個ITR之間的序列會(huì)被(bèi)包裝進(jìn就個)Cap結構蛋白組成(chén藍照g)的衣殼裡(lǐ)，成(chéng)爲得少含有病毒基因組DNA的病毒顆粒。

3. 一旦scAAV病毒感染細胞，病毒DNA會(huì)釋放并老機轉運至細胞核。在細胞核中，AAV dsDNA與宿主RNA聚合答訊酶結合，轉錄出shRNA分子，打靶宿主靶基因的mRNA了小。

關于該載體系統的更多信息，請參考以下文獻：