果蠅基因表達載體pUAST

概述

我們的pUAST載體系統是一個良好(hǎo)、高效的轉基因果蠅制備問不和基因表達控制系統。該系統來源于常用的果蠅P議光元件轉座子，結合強誘導型啓動子Gal4以調節轉基因表東舞達。

完整的pUAST系統包含兩(liǎ一他ng)個載體，一個載體被(bèi)稱爲pUAST質開著粒，包含兩(liǎng)個P元件末端重複，包黃暗括待轉座的區域或基因；另一個載體稱爲輔助質粒或轉座酶質粒，編碼P轉座章文酶。

當pUAST與轉座酶質粒共轉染靶細胞時(shí)吧民，輔助質粒産生的轉座酶識别pUAST質粒上的兩(liǎng你了)個P元件末端重複序列，然後(hòu)將(jiāng)待轉哥好座區和兩(liǎng)個P元件末端重複序列插入到宿主基因組中。

P元件屬于II類轉座子，通過(guò)“剪切—粘貼”的機制移動，從一個地方轉座微家到另一個地方，而不留下序列本身（恰好(hǎo)相也電反，I類轉座子是通過(guò)“複制—粘貼”的方式移動），在每一個插入位點都(廠舞dōu)會(huì)産生一個8 bp的正向(xiàng)重複序列事就。

通過(guò)將(jiāng)pUAST和輔助質粒共注射到果蠅早期火相胚胎中可以産生轉基因果蠅。P轉師美座酶介導兩(liǎng)個P元件末端重複序列之間的重組導緻生殖系重組交費從換，以緻産生攜帶靶基因的轉基因後(hòu)代。P轉座銀老酶僅在短時(shí)間内表達，并且随著(zh科小e)輔助質粒的丢失，轉座子在宿主基因組中的整合便成(chéng)爲永久性的。p土靜UAST載體上的 mini white基因的樹數表達，可以使果蠅的眼色發(fā)生變化，是鑒定也唱轉基因果蠅成(chéng)功與否的标記。或者也可以使用&nbs雪對p;PCR或其他分子方法鑒定轉費多基因細胞或動物。

在pUAST系統中，目的基因將(jiāng)被(bèi)克隆到合成(河草chéng)誘導型啓動子的下遊，該啓動子由5個串聯排列的GAL4結合電微位點（5xUAS）和hsp70 TATA box組成(ch物微éng)。目的基因依賴于GAL4的表達，GAL4蛋白在與pUAST質粒上的U愛這AS位點結合後(hòu)會(huì)激活目的基因的轉錄。因此，在沒(輛高méi)有GAL4表達的情況下，目的基因保持沉默，但是通過(guò)與表問公達GAL4的果蠅系雜交後(hòu)，在GAL4表達的細胞中，目的基因會(hu兵這ì)被(bèi)轉錄激活。

關于該載體系統的更多信息，請參考以下文獻。

參考文獻	主題
Development. 118:401 (1993)	Development and use o樹小f the pUAST inducible promoter s風做ystem
Methods Mol Biol. 420:61 (2008)	The use of P-element tr懂樹ansposons to generate transgenic fl樹黑ies

亮點

我們的pUAST果蠅基因表達載體可有效實現如樹P轉座酶介導的基因插入或目的基因GAL4依視商賴性表達。我們的載體在大腸杆菌中具有高拷貝，可用于高效産生轉基因果蠅。

優勢

高水平表達：5×UAS/mini_Hsp動店70啓動子可以在誘導狀态下使目的基因高水平表達。

選擇性表達: 不存在GAL4的情況下，目的基因的轉錄水平很低或沒微生(méi)有；在GAL4的存在下，則能(né坐我ng)實現高水平的基因轉錄。

不足之處

基因組随機插入：p元件的随機整合，使得插入位點難以定位，基因組位置也有可能(néng)影響轉基不得因的表達。此外，轉基因插入到基因或基因組車秒内的調控元件可能(néng)影響内源基因。

效率中等：使用P元件載體實現種(zhǒng)系轉基土姐因通常比φC31整合酶介導的系統（pUASTattB）效率到市低。

潛在的洩漏表達：在某些情況下，即使沒(méi)有GAL4，目的基因也會(huì)發(fā你地)生低水平洩漏表達。

技術複雜：轉基因果蠅的産生需要胚胎注射和飛行飼西日養，具有一定的技術複雜性。

載體關鍵元件

P-element 3’ end你子: Right terminal repea什計t, or 3' terminal rep術他eat, of the P element. Whe新窗n a DNA sequence is flanked by the 行服3’ and 5’ P-element terminal r樂動epeats, the P transposa媽但se can recognize the影一m and insert the flanked region in要農to the host genome.

5×UAS/mini_Hsp70: The Drosophila melanogaster heat 呢風shock protein 70 (Hsp70) min票車imal promoter fused with 拿多five tandem galactose但看 upstream activ多河ating sequences (5×UAS). T嗎雜his is a strong promoter, tightly indu光妹cible by GAL4.

Kozak: Kozak consensus 的學sequence. It is plac刀樂ed in front of the start codon 西西of the ORF of interest to facili男裡tate translation initiation in eukaryot什日es.

ORF: The open reading frame o音還f your gene of interest is pl朋村aced here.

SV40 terminator: Simian virus 40 transcri拍舞ptional terminat們風or. Contains the SV40 s員從mall T intron and the SV40 early 近外polyadenylation signal.

mini-white: A variant of the Drosophila white gen行知e. The mini-white gene is a dom錯美inant marker for adul還算t fruit fly eye co花畫lor, which can be used a森地s a reporter to identify transgenic eve可草nts in a white mutant 對們background.

P-element 5’ end: Left terminal repe畫但at, or 5' terminal 腦照repeat, of the P element. When國遠 a DNA sequence is flanked b都現y the 3’ and 5’ P-element ter門關minal repeats, 視業the P transposase can recogniz一友e them and insert the f分人lanked region into the host genome.

pUC ori: pUC origin of replication. Plasmids ca議計rrying this origin exist in high copy n低坐umbers in E. coli.

Ampicillin: Ampicillin resistance道兵 gene. It allow時公s the plasmid to be maintained b家生y ampicillin selection in E. c些綠oli.

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