Baculovirus-AAV嵌合病算冷毒載體

腺相關病毒（Adeno-associated v歌頻irus，AAV）無論在體内和體外試驗中均被女線(bèi)廣泛應用于基因轉導實驗。AAV可以感染大新拍量種(zhǒng)類的哺乳動物醫新細胞，在人體内隻産生極低的免疫城腦原性，這(zhè)些特點使重組AAV成(問時chéng)爲當今應用于基因治療的高效病毒載體。在基因治療的臨床前和臨床階段的務學研究中，可通過(guò)Baculovirus-道書AAV嵌合病毒載體高效且大規模生産重組AAV以符合劑量和安全性要求來房。

利用杆狀病毒（Baculovirus）生産重組AAV需票校要將(jiāng)兩(liǎng)種(zhǒng)杆狀病毒共轉導昆蟲Sf木兒9細胞。第一種(zhǒng)杆狀病毒表達位于兩(店河liǎng)個AAV ITR元件之間的目的基因，第二個杆狀病毒樹業表達AAV rep和cap基因。爲制備兩(liǎng)種(z說房hǒng)杆狀病毒，每種(zhǒng)杆狀病毒的表達框均被(bèi)克隆至一朋火個杆狀病毒轉移質粒。該質粒的整個表達框與上車慶大黴素（Gentamycin）抗性基因位于質粒上的兩地場(liǎng)個Tn7轉座子末端序列之間（Tn7L和Tn7R有答）。該質粒被(bèi)轉化至帶刀雨有杆粒（Bacmid）和輔助載體的大腸杆菌。杆粒可以被(動上bèi)看作一個特别巨大的質粒，包含了修飾會坐過(guò)後(hòu)的杆狀病毒基因組序列。該序列上帶有lacZ基因土家以及位于該基因内部的attTn7位點。離看因此轉移質粒上兩(liǎng)個Tn7之間的序列通過(了資guò)Tn7轉座酶與杆粒重組後(hòu)將(jiāng)插入lacZ藍都基因，随後(hòu)通過(guò)慶大黴素抗性篩選和藍白廠刀篩選即可獲得重組成(chéng)少頻功的大腸杆菌。從大腸杆菌提取的杆粒純化後爸輛(hòu)用于轉染昆蟲Sf9細胞。

我們的baculovirus-AAV嵌合病森錯毒載體表達的定制目的基因位于兩(liǎng)個不舊AAV ITR元件之間。利用該載體南海生産的重組杆狀病毒與表達AAV rep和cap基看飛因的輔助杆狀病毒可共轉導至昆蟲細胞，學子然後(hòu)利用昆蟲細胞中大分說規模制備重組AAV。

使用AAV轉導宿主細胞時(shí)，兩(li窗購ǎng)個ITR之間的外源DNA及病毒基因組一同進(j長你ìn)入細胞，線性雙鏈DNA基因組以遊離體DNA的形式存在于細胞核中。在分裂小南細胞中，由于遊離體DNA不跟随細胞複制，AAV基因組場這將(jiāng)随著(zhe)細胞分裂逐漸丢失，因此在整體細胞中拍輛被(bèi)稀釋。重組AAV的通通DNA随機整合宿主基因組的現象是非常罕見匠懂的，這(zhè)對(duì)于需要考慮外源DNA插入嗎雜宿主基因組引發(fā)緻癌風險的基因治療習和來說(shuō)是相當适用的特點。

AAV的另一個應用優點在于，在大多數情況下，可以在生物安全1級（B紙市SL1）設施中完成(chéng)操作。重組AAV是複制缺陷型到爸的，不會(huì)引起(qǐ)炎症反應和引說呢發(fā)人類疾病。

人們已從自然界中鑒定出許多AAV病毒株，根據病毒表面(miàn)衣殼蛋白地子的不同抗原將(jiāng)它們分成(chéng)不就子同的血清型。不同血清型的病毒具有不同的組織嗜性（即感染組織特異性）。當算錯我們的AAV載體使用不同的衣殼蛋白包裝病毒時(s裡業hí)，則會(huì)賦予病毒不同的血清型。目前我們使用Bacul和離ovirus-AAV嵌合病毒載體包裝的AAV提供以下幾種(zh業多ǒng)血清型：AAV1、2、6、8和9。AAV機外包裝時(shí)的ITR序列來源于AAV2，這(zhè)是一種(zhǒn紅銀g)常用的AAV載體構建方式，不影響血清型。另一方面票友(miàn)，決定血清型的衣殼蛋白基因由Re訊花p/Cap包裝質粒編碼。關于AAV的更舞路多血清型信息，請參照下表。

關于該載體系統的更多信息，請參照以下文獻。

Baculovirus-AAV嵌合病毒載體可以用于高效地并大規模生産重從習組AAV。我們的載體系統經(jīng)過(guò)優化，可以在民內大腸杆菌中以高拷貝數形式複制，中間需要包女可裝出高滴度的重組杆狀病毒，最後(hòu)制備的AAV具有很低的安全風險。

高效與易放大：Sf9昆蟲細胞可以在大型生物反應器中以高密度的懸浮細胞方式培養，因此用其市師生産AAV，對(duì)比傳統利用哺乳動物細胞制備AAV的方法更高效、生産上通科更易放大規模。

安全性高：杆狀病毒對(duì)于哺乳動物和植物是非緻病性的，市來并且不能(néng)在昆蟲細胞外複制。因此，使用昆蟲購動細胞株的生産環境僅需要最低的生物安全等級。此外，昆蟲細胞的培養使用的是無血要區清培養基，排除了任何動物源成(chéng)分，進(jì黃場n)一步強化了該載體系統的生物安全事章性。使用該系統生産的重組AAV仍然是複制缺請算陷型的，不會(huì)引發(fā)任何人類疾病。

對(duì)宿主基因組造成(chéng)破壞的低風險性：在轉導進(jìn)入靶細胞後(h樂銀òu)，AAV基因組在細胞核保持著(zhe)遊離DNA的狀态，地師可以降低宿主基因組被(bèi)破壞而知從緻癌的風險，使其成(chéng)爲人類體内實驗的理雜對想載體。

高病毒滴度：利用我們的baculovirus-AAV嵌合病毒載體可以包裝成(chéng)高呢說滴度的AAV病毒。經(jīng)Sf9昆蟲細胞生産的AAV病毒其滴度道匠可達到>10¹³ GC/ml。

宿主範圍廣：針對(duì)不同來源的常用哺乳動物（如人文話、小鼠和大鼠）細胞和組織，將(jiāng)我們的AAV鐵銀載體包裝成(chéng)對(duì)其具有親和性的血清型筆街，可輕易實現高效轉導。但是，某些類型的細胞仍然難以木讀轉導（見下文不足之處），這(zhè)與所廠裡用的血清型有關。

體内外實驗均有效：我們的載體不僅能(néng)用于體内活體動物實驗，還(hái)具有體外細習坐胞轉導能(néng)力。

5' ITR: 5' inverted termi區用nal repeat. In wild ty機公pe virus, 5' ITR 土是and 3' ITR are essentially id你船entical in sequence. Th近影ey reside on two ends of the他筆 viral genome p他秒ointing in oppos快鐘ite directions, where they s房弟erve as the origin of viral genom對作e replication.

Promoter: The promoter that drives your gen的街e of interest is placed h答上ere.

Kozak: Kozak consensus seque讀視nce. It is placed in front of 山開the start codon生人 of the ORF of interest to facili從空tate translation initiation in eukary錢亮otes.

ORF: The open reading 好店frame of your gene of interest is pla書票ced here.

BGH pA: Bovine growth hormon信你e polyadenylation signal. It facilitate機科s transcriptional termination of the u問現pstream ORF.

3' ITR: 3' inverted terminal repeat. See筆就 description for 5’ ITR.

Tn7L: Tn7 transposon left termina睡在l element. It is 信水recognized by Tn7 trans說就posase. DNA flanked by Tn7R an兒舊d Tn7L can be transposed by Tn7 tran答船sposase into attTn7 docki自店ng sites.

Ampicillin: Ampicillin resistance gene. 上紅It allows the plas做事mid to be maintained by ampicill山到in selection in E. col都拍i.

pUC ori: pUC origin of replication子時. Plasmids carrying t藍到his origin exist in high copy number要視s in E. coli.

Tn7R: Tn7 transposon right t森她erminal element. 微會It is recognized 農男by Tn7 transposase. D用來NA flanked by Tn7R and Tn7L can be tra雜房nsposed by Tn7 transposase int窗請o attTn7 docking sites關身.

Gentamicin: Gentamicin resistance gene.大制 It allows for drug selection of 微聽E. coli carrying recombinant 山中bacmids.

Baculovirus-AAV嵌合病毒載體可以用于高效區筆地并大規模生産重組AAV。我們的載體系統經(jīng)過(算輛guò)優化，可以在大腸杆菌中以高拷貝形式哥下複制，中間需要包裝出高滴度的重組杆狀病毒，最後(h城跳òu)制備的AAV具有很低的安全風險。

高效與易放大：Sf9昆蟲細胞可以在大型生物反應器中以高密度的懸浮細胞方式培養，因此用其生産A技他AV，對(duì)比傳統利用哺乳動物細胞制備AAV的方法更高效、生那們産上更易放大規模。

安全性高：杆狀病毒對(duì)于哺乳動物和植物店體是非緻病性的，并且不能(néng)在昆蟲細胞外複制。因兵近此，使用昆蟲細胞株的生産環境僅需要最低的生物安全等級。此外，昆蟲分什細胞的培養使用的是無血清培養基，排除了任何動物源成(ch裡區éng)分，進(jìn)一步強化了該載體系統的生物安全性。使用該月湖系統生産的重組AAV仍然是複制缺陷型的，不會(h購綠uì)引發(fā)任何人類疾病。

對(duì)宿主基因組造成(chéng)破壞的低風險音店性：在轉導進(jìn)入靶細胞後(hòu)，就是AAV基因組在細胞核保持著(zh藍從e)遊離DNA的狀态，可以降低宿主基因組被(b玩線èi)破壞而緻癌的風險，使其成(ch南對éng)爲人類體内實驗的理想載體。

高病毒滴度：利用我們的baculovirus討要-AAV嵌合病毒載體可以包裝成(chéng)高滴度的A開亮AV病毒。經(jīng)Sf9昆蟲細胞生産的AAV病毒其滴度可達到東公>10¹³ GC/ml。

宿主範圍廣：針對(duì)不同來源的常用哺乳動物（如人、小鼠和大鼠）細胞和組織，將(jiā唱師ng)我們的AAV載體包裝成(chéng)對(duì)其具有親和性的血清型費玩，可輕易實現高效轉導。但是，某些類型的細遠電胞仍然難以轉導（見下文不足之處），這(zhè)與所用的血清型離用有關。

體内外實驗均有效：我們的載體不僅能(néng)用于體内活體動物市體實驗，還(hái)具有體外細胞轉導能(n我爸éng)力。

載體容量小：AAV是我們所有病毒載體系統中兵拿裝載量最小的。AAV的兩(liǎng)個IT村是R之間所能(néng)容納的最大序列長(cháng)度是4.7 kb，允房謝許使用者插入~4.2 kb的目的序列。

難以轉導特定類型的細胞：當利用合适的血清型進(jìn)行包裝時(shí)睡都，我們的AAV載體系統可以轉導很多不同類家理型的細胞，包括非分裂細胞。不同AAV血清型對(duì)不窗些同類型的細胞具有不同的嗜性，針對(duì)某種(zhǒng)特定理森類型的細胞需要特定血清型。 

技術複雜：通過(guò)baculovirus-AAV表達系統拿呢生成(chéng)重組AAV需要多個步驟，包就兵括克隆目的基因至杆狀病毒轉移載體、從轉移載體制備重組杆粒、微黃杆粒轉染并使用杆狀病毒轉導昆蟲細胞等，這(zhè吃司)些步驟相對(duì)于傳統的三質粒轉染法生産AAV具有更高的技術複雜性、花費鐵喝時(shí)間也更長(chán高山g)。通過(guò)訂購我們的基于baculovir但靜us-AAV嵌合病毒載體的AAV包裝服務可以輕松解決這(zhè)些問題。

5' ITR: 5' inverted terminal repeat.技你 In wild type virus, 5' I妹麗TR and 3' ITR are essenti理海ally identical in sequence. They r農都eside on two ends of the妹路 viral genome pointing in oppos商用ite directions, where they ser南鐵ve as the origin of vira快舞l genome replicatio信得n.

Promoter: The promoter that drives your gene o刀拿f interest is placed here.

Kozak: Kozak consensus sequence. It is p廠木laced in front of t河醫he start codon of the ORF of interest 師亮to facilitate transl兒到ation initiation in eukaryotes玩都.

ORF: The open reading frame of yo術鐘ur gene of interest is placed here些在.

BGH pA: Bovine growth hormone p家為olyadenylation signal. It facil錯店itates transcriptional termination of 店報the upstream ORF.

3' ITR: 3' inverted termina下什l repeat. See description f輛村or 5’ ITR.

Tn7L: Tn7 transposon left termi跳路nal element. It is recognized 水影by Tn7 transposase. DNA生訊 flanked by Tn7R and Tn7L can be trans科亮posed by Tn7 transposase into attTn7土窗 docking sites.

Ampicillin: Ampicillin resistance gene. It 紅金allows the plasmid to b電鐘e maintained by ampicillin sele那問ction in E. coli.

pUC ori: pUC origin of repl動能ication. Plasmids carrying this orig上家in exist in high copy numbers in E.場服 coli.

Tn7R: Tn7 transposon right termina了男l element. It is recognized by Tn7大時 transposase. DNA fl湖道anked by Tn7R and Tn7L爸鐘 can be transposed by Tn7 transposase校厭 into attTn7 doc媽為king sites.

Gentamicin: Gentamicin resis腦制tance gene. It allow算南s for drug selection of E. coli c行校arrying recombinant bacmid北樂s.