重組狂犬病毒（RABV）

運輸與存儲

我們的RABV病毒保存于HBSS緩沖液，并以幹冰形式運輸。接在做收到病毒後(hòu)，RABV可以在-8愛數0°C長(cháng)期存儲（可至少穩定存儲6個月），或者在-20&d視地eg;C存儲一周。RABV的保質工歌期約爲1年。請避免反複凍融RABV以避金笑免顯著的滴度下降。

RABV制備與質量控制

RABV包裝流程如圖2所示。攜帶GOI的轉移質粒、分别攜帶RAB樂光V G、N、P、L基因的包裝質粒、以及一個表達T7時身 RNA聚合酶的質粒一同轉染包裝間年細胞。包裝質粒表達的病毒蛋白對(duì謝友)于含有目的基因的病毒顆粒組裝是必須的。制備覆蓋有G糖蛋白的RAB可綠V後(hòu)，收集細胞上清，再次北東感染包裝細胞。此時(shí)若同時(shí)轉染一個表達異源唱唱包膜蛋白的質粒（比如表達EnvA），則可以獲得假型化的RABV病可習毒。對(duì)于非純化的RABV病毒（體外應用級别），使用超速離去輛心法濃縮純化。對(duì)于超純化的RABV病毒（刀理體内應用級别），使用蔗糖密度梯度離心法濃縮純化。我們使用噬斑法檢測滴度水道。

圖2 典型的RABV包裝流程。

對(duì)于每一個生産的重組RABV病毒，質量控制包括滴度檢測、無菌測間靜試、支原體檢測等。如果RABV病毒載體表達熒光蛋白，則我們會(huì)車匠進(jìn)行熒光轉導測試。如果RABV病毒載體含有藥篩煙會标記，我們也會(huì)在轉導測試後(hòu)伴随進(jìn)行藥篩測試。此紙信外，對(duì)于超純化RABV，我們會(huì)進(jìn)綠現行内毒素檢測。

試驗驗證

我們的RABV經(jīng)詳盡驗證可以有效轉導多種吃路(zhǒng)細胞類型，包括表達TVA受體的細胞 （圖3）

圖3 表達EGFP的RABV轉導293T細胞（表達或無表達TVA）。轉導後(hòu房靜)48小時(shí)使用熒光顯微鏡成(chéng)像。放大倍數：10道商0×。左：明場。右：EGFP。

RABV背景知識

RABV是一種(zhǒng)負鏈RN樹鐵A病毒，屬于彈狀病毒科。RABV基因組長討下(cháng)度約爲12 kb，可以插入3-5 kb的轉基因片段。該坐聽病毒使用G糖蛋白來識别通常在神經(j農美īng)元軸突末端發(fā)現的各種(zhǒng)受體。一旦進(jì生少n)入軸突末端，病毒就(jiù)會(huì)逆行傳輸到細胞體，并在那視事裡(lǐ)進(jìn)行複制。RABV的病毒複制和轉錄均發(fā)生在細胞質山器中，最大限度地減少了整合宿主基因組的風險，且降低了病毒生命周期黑鐵對(duì)宿主機制的依賴。

複制後(hòu)的病毒被(bèi)随後(hòu)運輸到神經(jīng)元樹突，會坐并以出芽方式釋放。這(zhè)種(zhǒng得近)高度嗜神經(jīng)性的病毒僅能(néng)通過(guò)化學(短和xué)突觸傳播到其他細胞，感染新的軸突末端，并經(jīng)由外周和中樞神讀師經(jīng)系統繼續傳播到突觸前神經(jī錯姐ng)元。

RABV載體的主要應用

神經(jīng)網絡展示

重組RABV主要用于神經(jīng)網絡的突觸追們作蹤（圖4）。RABV有著(zhe)逆行傳輸以及跨突觸傳播的限的去制，因此可實現對(duì)神經(jīng)連接的特定可視農你化和調控。RABV載體通常缺失G糖蛋白基因，因此病毒在感染一級神經(票來jīng)元後(hòu)無法傳到她播至其它細胞。 然而，當病毒被(bèi)引入具有G糖蛋白公畫表達的細胞時(shí)（比如通過(guò)AAV秒火轉導引入），可産生的功能(néng)性病毒，然後(hòu)傳播且中朋隻能(néng)傳播至上遊二級神經(jīng)元，實現單山中突觸追蹤。

特定神經(jīng)元中的單突觸連接研究也舞報是一種(zhǒng)常見的實驗術關需求。使用EnvA/TVA系統將(jiāng)員音允許病毒靶向(xiàng)特定神經(jīng)元：整合了E去能nvA包膜蛋白的假型化RABV特異他生性感染同時(shí)表達TVA受體以及G糖蛋白的一級神經(jīng)元。這(腦舞zhè)將(jiāng)确保隻有靶細胞被(bèi區空)重組RABV感染，并允許對(duì身喝)所有直接輸入進(jìn)行單突觸追蹤。

圖4 重組RABV的生産、轉導和感染。

疫苗制備

狂犬病是一種(zhǒng)出現症狀後(hòu)緻死率接近100%的疾病，音刀其疫苗的開(kāi)發(fā)也是一個熱點問題。目前滅少員活RABV是最常用的疫苗載體形式，但是習風具備自我複制能(néng)力的重組RABV疫苗載體微物也在被(bèi)進(jìn)一步研究。 HEP-Flury線森毒株因其高度減毒、低緻病性和較強的免疫原跳窗性而特别适合于該種(zhǒng)應用。

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文檔

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