哺乳動物非編碼RNA表達質粒載體

概述

常規非編碼RNA表達質粒載體是事劇在多種(zhǒng)哺乳動物細胞中轉染和表達非編碼RN機明A的高效工具。非編碼RNA是一類長(cháng)度小于30個核苷酸或者大能器于200個核苷酸的功能(néng)性RN民白A，包括：小分子RNA（micro RNA, miRNA）、小幹擾RN討雜A（small interfering RNA, siR說在NA）、Piwi蛋白互作RNA（piwi-inte多他racting RNA, piRNA）,小核RNA（船友small nuclear RNA, snRNA）、核仁小RNA工自（small nucleolar RNA, snoRNA）、基因唱她間長(cháng)鏈非編碼RNA （large inter風開genic non-coding RNA, lincRNA）、内含子長(綠就cháng)鏈非編碼RNA（intronic lon得行g non-coding RNA, i飛唱ntronic lncRNA）、天然風好反義轉錄物（natural antisense tra話相nscripts, NAT）、唱文增強子RNA（enhancer RNA , eRNA）和照自啓動子相關RNA（promoter-associated 亮區RNA , PAR）等。所有這(zhè)些非編碼RNA均飛答不被(bèi)翻譯成(chéng)蛋白質，但是在許多細也妹胞生理過(guò)程中扮演了重要角色靜畫，如DNA複制、表觀遺傳調控、轉錄和轉錄後(h船還òu)調控、以及翻譯調控等。

常規的非編碼RNA表達質粒載體使器但用RNA聚合酶II型啓動子驅動用戶定制的自時非編碼RNA的表達，可采用組織特異性、誘導型、議市或者驅動強度不同的啓動子以滿足不同的實驗在費需求。對(duì)于RNA聚合酶II介導的轉錄過(guò)程，其做紙轉錄起(qǐ)始位點位于啓動子和可的3‘端，而終止位點位于Poly A序列。因吧鄉此該載體的非編碼RNA序列的轉錄本帶有一些額外的上遊和下遊序列。

該載體可以用于轉染多種(zhǒn微機g)類型的哺乳動物細胞。在生物醫學(xué)領域，常規質粒轉染區愛是將(jiāng)質粒載體導入哺乳動物志醫細胞中是最廣泛的方法。雖然近年來開(kāi)發(fā)了不少更爲先進拍裡(jìn)的基因導入載體系統（如慢病毒載體、腺病毒載體、AAV載體和pig房開gyBac等），但常規質粒轉染仍被(bèi)大多數實驗室使用，這(zh愛現è)主要得益于其在技術上的簡便性以及在各跳訊種(zhǒng)類型細胞中的高效轉染率。常規質粒載體轉染的關對技鍵特點是短暫性，并且在宿主基因組中的整合效率非常低（妹月通常小于1%）。

參考文獻	主題
Cell. 157:77 (2014)	Review on non-coding RNAs
Front Genet. 6:2 (20影市15)	Review on functionality of n書車on-coding RNAs
Oncogene. 30:4750 (2011)	Regular plasmid mediat章她ed expression of long no音影n-coding RNA

亮點

我們的非編碼RNA質粒表達載體系統已經(jīng)過(guò)優化，其在大可雜腸杆菌中具有高拷貝複制能(néng)力，且對(duì)細胞具有高效村個轉染率。根據用戶選擇的篩選标記基因，可對(duì)轉請坐染了該載體的細胞進(jìn)行篩選或者可刀答視化追蹤。

優勢

技術簡單：常規轉染即可把質粒轉入細胞，相比起(技數qǐ)病毒載體需要進(jìn)行病毒包裝，過(guò)程更簡單。

載體容量非常大：我們的載體總容量可達30 kb，其中質粒骨架隻占3 kb，有足夠大的容量可以鐵街放置客戶所感興趣的序列。

高水平表達：常規質粒轉染細胞後(hòu)，可以産生非常高的短嗎拷貝數（每個細胞多達幾千拷貝），使外源基因能(néng)司說高水平表達。

不足之處

瞬時(shí)轉染：常規質粒在細胞裡(lǐ)主要以遊議輛離DNA狀态存在，所以常規質粒說樹轉染也稱爲瞬時(shí)轉染。然而，質粒DNA也可以以非常低的概率永久整合線嗎到宿主基因組中（質粒轉染每10²~10⁶個細胞可能(néng)會(huì)有一個細家學胞的基因組被(bèi)整合，整合效率取決于細胞類型）。如果將(j哥是iāng)攜帶了藥物抗性基因或者熒光标記基因的載體轉到細胞中，在經(區看jīng)過(guò)擴大和傳代培養後(hòu)，可以使用藥物篩選或細胞分選風店來獲得穩定整合了該載體的細胞。

可轉染的細胞類型受限：不同類型細胞的質粒轉染效率差異很大。非分裂細胞比分裂細胞更難轉染，原代細胞比到機永生化細胞系更難轉染。一些重要的細胞類型更是難以轉染，如神經(jīng)元男紙和胰島β細胞。另外，質粒轉染局限于體外細胞實驗作為，很少運用到活體實驗。

基因拷貝數在不同細胞中呈現差異性：盡管成(chéng)功的轉染可器理以在單個細胞裡(lǐ)産生非常高的拷貝數，但不同細胞間卻有高度的差異海媽性。在一些細胞中，質粒拷貝數非常高，而在內答另外一些細胞卻是低拷貝甚至沒(méi)有。而病毒轉導更傾向店時(xiàng)于相對(duì)均勻地把基因轉到細胞中。

載體關鍵元件

Promoter: The promote工票r that drives your 海厭non-coding RNA of interest is pla商筆ced here.

Non-coding RNA: The non-coding RNA o林什f your interest 務熱is placed here.

SV40 late pA: Simian virus 40 late polyade錯笑nylation signal. It facilitates電熱 transcriptional termination 上技of the upstream non-cod照慢ing RNA.

CMV promoter: Human cytomegalovir唱裡us immediate early promoter. 遠兒It drives the ubiquitous ex聽志pression of the downstream ma女大rker gene.

Marker: A drug selection 動事gene (such as neomycin res購科istance), a visually detectable g也答ene (such as EGFP)裡國, or a dual-reporte光紙r gene (such as 大個EGFP/Neo). This allows cells trans房音duced with the vector to 腦見be selected and/or visu光拿alized.

BGH pA: Bovine growth hormone p校草olyadenylation. 刀跳It facilitates transcriptional term暗科ination of the upstream ORF.

pUC ori: pUC origin of replicatio聽中n. Plasmids carrying this 暗數origin exist in high copy numbe海舞rs in E. coli.

Ampicillin: Ampicillin resistance gene. It 影秒allows the plasmid to be mai件師ntained by ampicillin selection 影作in E. coli.

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