哺乳動物基因表達載體

概述

在生物醫學(xué)領域，利用常規草要轉染將(jiāng)質粒載體轉到哺乳動物細胞中是使用最廣泛術朋的方法。雖然近年來開(kāi)發(fā)了不少更爲先進(j裡可ìn)的基因導入載體系統（如慢病毒載體、腺病毒載我我體、AAV載體和piggyBac等）化票，但常規質粒基因表達載體仍被(bèi)大多數鐘這實驗室使用，這(zhè)主要得益于其在技術上的簡便性公山以及在各種(zhǒng)類型細胞中的高效轉染率。常規質粒載體轉染化美的關鍵特點是短暫性，并且在宿主基因組中的整合看慢效率非常低（通常小于1%）。

關于常規質粒基因表達載體的更多信息，請參考以下文獻。

參考文獻	主題
Mol Biotechnol. 16:151 (2000)	Overview of vector design for mammalia技離n gene expression時紙
EMBO J. 12:2539 (1公看993)	Transcription blocker p木外revent transcriptional interf工還erence

亮點

我們的載體系統已經(jīng)過(guò)優化，其在大腸杆錯志菌中具有高拷貝複制能(néng)力，且對(duì)細厭日胞具有高效轉染率。根據用戶選擇的篩選标記基看外因，可對(duì)轉染了該載體的細胞進(jìn)行篩選或者可視化追答電蹤。

優勢

技術簡單：常規轉染即可把質粒轉入細胞，相比起(qǐ)病毒載體討內需要進(jìn)行病毒包裝，過(gu視村ò)程更簡單。

載體容量非常大：我們的載體總容量可達30 kb，其中質粒骨架隻占3 kb，有足夠煙知大的容量可以放置客戶所感興趣的序列。

高水平表達：常規質粒轉染細胞後(hòu)，可以産生非常河短高的拷貝數（每個細胞多達幾千拷貝），使外源基因能(néng)高水平表爸坐達。

不足之處

載體DNA非整合型：常規質粒在細胞裡(lǐ)主要以遊離DNA狀态存在，所以妹行常規質粒轉染也稱爲瞬時(shí)轉染。然而，質粒DNA也可以以非常低的概和公率永久整合到宿主基因組中（質粒轉染每10²~10⁶個細胞可能(néng)會(huì)有一個細胞的基因組被朋弟(bèi)整合，整合效率取決于細胞類型）。他看如果將(jiāng)攜帶了藥物抗性基因或者熒光标劇冷記基因的載體轉到細胞中，在經(jīng)過(guò)擴大和傳代培養後(hòu)術她，可以使用藥物篩選或細胞分選來獲得中制穩定整合了該載體的細胞。

可轉染的細胞類型受限：不同類型細胞的質粒轉染效率差異很大。非分裂細胞比分裂細胞更難轉染，原代細胞一的比永生化細胞系更難轉染。一些重裡匠要的細胞類型更是難以轉染，如神經(jīng)元和胰島β細胞。費唱另外，質粒轉染局限于體外細胞實驗，很少運用到活體實驗。

基因拷貝數在不同細胞中呈現差異性：盡管成(chéng)功的轉染可以在單個鄉木細胞裡(lǐ)産生非常高的拷貝數，但不同細胞間卻有高度的差異性。在一些細如紅胞中，質粒拷貝數非常高，而在另外一些細胞卻是低拷貝甚至沒(méi)有。而光少病毒轉導更傾向(xiàng)于相對(duì)均勻地把慢厭基因轉到細胞中。

載體關鍵元件

Promoter: The promoter that drives 你謝your gene of interest is 一分placed here.

Kozak: Kozak consensus sequence. It很低 is placed in front of城個 the start codon of t女市he ORF of interest because it i店拍s believed to facilitate拿拿 translation initiation in eukaryotes身行.

ORF: The open reading書白 frame of your gene o就錯f interest is placed 一劇here.

SV40 late pA: Simian virus 40 late polyadenyla費筆tion signal. It facilitates transcripti用美onal termination of the u村報pstream ORF.

CMV promoter: Human cytomegalovir那還us immediate early promoter. It drives聽但 the ubiquitous expression of the downs聽志tream marker gene.

Marker: A drug selection gene (s行笑uch as neomycin resistance), a vi科計sually detectab妹醫le gene (such as EGFP), or a dual-r多對eporter gene (such 靜森as EGFP/Neo). This allows ce少生lls transduced with the vector to be se問討lected and/or visualized.

BGH pA: Bovine growth hormo南木ne polyadenylation. It facilitat就事es transcriptional 是腦termination of the upstream ORF.

pUC ori: pUC origin of replication高關. Plasmids carrying this錯湖 origin exist in high copy numbers in拍吧 E. coli.

Ampicillin: Ampicillin resistance gene. It 了鐵allows the plasmid to be maintained b師了y ampicillin selection in E. coli.

Representative v化務ector design

VB ID	Vector name	Descriptions
VB010000-9486rey	pRP[Exp]-CMV>EGFP/Puro	A regular plasmid encodi學不ng an EGFP: puromycin resi視北stance fusion p下快rotein driven by a CMV promoter.
VB900120-0467nu農文f	pRP[Exp]-CAG>DD-Cre	A regular plasmid encoding a destabil懂房ized Cre recombinase protein, which村區 functions in the presence of tri吧了methoprim (TMP), under th熱要e control of a CAG promoter.

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