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CRISPR基因編輯解決方案&nbs工懂p;
shRNA基因敲低解決方案
概述
FLEX條件性表達腺病毒載體結合了載微討體家的高效的腺病毒載體系統和Cre響應的懂師FLEX條件性基因表達載體，可以幫助您實現在多種(zh畫員ǒng)多樣(yàng)的哺乳動物妹術細胞中以腺病毒轉導Cre響應的FLEX基因表放資達調控開(kāi)關。FLEX Cre-Off系統利用位于目的基因兩(li開西ǎng)側的Lox-變體重組位點，在Cre重組酶的調控下目的基因發(fā)生冷光反轉，目的基因表達被(bèi)抑制。
FLEX Cre-off系統由兩(liǎng)對(duì)異資草型Lox-變體重組位點組成(chéng)，其中野生型序列稱爲LoxP在媽，突變體稱爲Lox2272，分别位于ORF的兩電體(liǎng)側。 兩(liǎng)種(zhǒng)Lox-變體都(dōu門身)可被(bèi)Cre識别，但隻有相同的Lox位點對(duì)可以彼說子此重組，與其他Lox-變體不能(néng)進(jìn)行重組。 物市LoxP和Lox2272位點以交替方式位于ORF兩(li動拿ǎng)端，每對(duì)位點互爲反向(xiàng)。Cre重組酶著拿不存在的情況下，客戶定制的啓動中工子可以驅動目的基因的正常表達。Cre重組厭開酶存在的情況下，LoxP和Lox2272位點對(duì)分别歌房重組，導緻ORF方向(xiàng)反轉爲反向(xiàng)，且其中的一對(d街外uì)重組位點將(jiāng)具有相同的方照跳向(xiàng)，Cre會(huì)介導産生正向(xiàng)重組切割，繼而分身西别留下一個不同的重組位點。ORF方向(xiàng)的反轉，使得目的基靜飛因無法正常表達。由于ORF側翼是兩(liǎng)個不同的Lox-變體位點，所子話以即使存在Cre也不會(huì)進(jìn)一步發(fā)生重組。
腺病毒載體首先是以質粒的方式構建并使用E. coli擴增，然後(hòu)線暗樂性化後(hòu)轉染進(jìn錯見)入包裝細胞。在包裝過(guò)程中，位于兩(liǎng)個反向(xià北農ng)重複序列（ITR）之間的DNA片段與由包裝細胞表達的病毒蛋白進紙光(jìn)一步包裝成(chéng)化間病毒顆粒。對(duì)于上述的FLEX介導黑林的Cre-Off條件性表達腺病毒載體，FLEX Cre-Off開(kāi件喝)關位于兩(liǎng)個ITR之間。當病毒轉導宿主行長細胞時(shí)，載體并以遊離DNA的形式存在于細胞核中。內外
通過(guò)改造優化，我們的腺病毒載體缺失了E1A、E1B和E3區，前兩(熱技liǎng)者與病毒包裝相關（這自站(zhè)兩(liǎng)個基因已被(bèi)舞就整合到包裝細胞的基因組中）。因此光答，運用我們的病毒載體包裝出來的病毒是複制缺陷哥討型的（隻能(néng)轉導靶細胞而不能(néng)自我複制），大大提土我高了生物安全性。
關于該載體系統的更多信息，請參考以下文獻。秒用
| 參考文獻 | 主題 |
|---|---|
| Proc Natl Acad Sci U S A行志. 91:8802 (1994) | The 2nd generation adenovi房門rus vectors |
| J Gen Virol. 36:59 (1977) | A packaging cell line fo答輛r adenovirus vectors |
| J Virol. 79:5437 (2005) | Replication-com機還petent adenovirus (RCA) fo制校rmation in 293 Cells |
| Gene Ther. 3:75 (1996) | A cell line for testing RCA |
| Gene. 216:55 (1998) | Characterization of LoxP m家到utants, including Lox2272 |
| Nat Biotechnol. 21:562 (校還2003) | Development of 藍火the FLEX switch system |
| J Neurosci. 28:鄉哥7025 (2008) | Application of a FLEX switch數能 system |
亮點
FLEX Cre-Off條件性表達腺病毒載體專爲在哺乳動物細胞中實作麗現高效的目的基因調控表達而設計。目的基因秒們受到用戶自定義的啓動子調節并且默站校認爲表達，但是可以在Cre重組酶存河空在的情況下反轉ORF編碼方向(xiàn火購g)使目的基因失活。
該載體由血清型5（Ad5）腺病毒衍生而來。經(jīng)優化，該紙我載體系統在大腸杆菌體内具有很高的拷貝數，包裝的活病毒具有很高長慢的滴度，對(duì)大多數宿主細胞具有子笑高效的轉導能(néng)力，能(néng)有效地把載體整合到靶路技細胞基因組并實現外源基因的高水平表達。
優勢
基因失活可控：Cre重組酶存在的情況下，ORF方向(技爸xiàng)轉爲反向(xiàng)，可防止基因發(fā)生洩漏表見水達。
基因穩定失活：在Cre的存在下，LoxP和Lox2272位點對(duì)分别重化關組，導緻ORF方向(xiàng)永久性地轉爲反向(xiàng)，且其中呢廠的一對(duì)重組位點將(jiāng)店秒具有相同的方向(xiàng)，地兒Cre會(huì)介導産生正向(xiàng)習我重組切割，繼而在ORF的兩(liǎng)端留下兩(liǎng)個不同的線房Lox-變體，即使存在Cre也不會(huì)進(jìn)子東一步發(fā)生重組，使得目的基因的表達永久失活。
對(duì)宿主基因組造成(chéng)破壞的低都美風險性：在轉導進(jìn)入靶細胞後(hòu)，腺病毒載體在細胞核船信保持著(zhe)遊離DNA的狀态，可以降低宿主基因組被(bèi)破壞而緻癌的風又藍險，使其成(chéng)爲人類體内行亮實驗的理想載體。
超高病毒滴度：腺病毒可通過(guò)再次轉導包裝細胞而得到大量擴增，從而獲得超話照高滴度病毒，慢病毒載體、逆轉錄病毒載體和AAV載體都(dōu)不具有這(zhè哥中)個特性。我們提供的腺病毒滴度可以達到>1012 VP/ml。
載體容量非常大：腺病毒能(néng)有效包裝的基因組上限大小是~38.7 kb（從5' IT器信R到3' ITR）。在除去腺病毒包裝表達所需主要元件所讀工占用的容量之後(hòu)，我們的載體具有約~7.5 kb的自化裝載空間以容納目的DNA（例如啓動子，ORF和從討熒光标記）。相比起(qǐ)容量爲6.4 kb的慢病毒表達載體，腺病毒載體容量更山討大，能(néng)滿絕大多數應用要求。
宿主範圍廣泛：來源于人、小鼠和大鼠等常用哺乳動物細胞都(dōu)能(néng)被(bèi聽黑)腺病毒載體轉導，但某些細胞類型則匠說比較難轉導（見下文不足之處）。
體内外實驗均有效：我們的載體不僅能(néng)用于體腦這内活體動物實驗，還(hái)具有吃畫體外細胞轉導能(néng)力。
安全性高：爲了确保腺病毒載體的生物安全性，我們空拿的腺病毒載體缺失了病毒包裝所必木文須的基因（這(zhè)些基因被(bèi)整合到包裝細胞的基因組）。 所民煙以，利用我們的腺病毒載體包裝出來的病毒是複制缺陷型的，并且隻有在包裝細胞離什中才具有複制能(néng)力。
不足之處
載體DNA非整合型：腺病毒基因組不會(huì)整合到靶細胞的基因組中，而是以遊離D有民NA的形式存在，并且随著(zhe)時(shí)間推移逐漸丢失，特别照友是在分裂細胞中。
難以轉導特定類型的細胞：雖然我們的腺病毒載體可以轉導很多類匠吧型的細胞包括非分裂細胞，但對(duì)某些特定類型的細胞如内皮細胞體妹、平滑肌細胞、呼吸上皮分化細胞、外周血細胞、神經(jīng)元和造血幹細胞等公靜，卻無法進(jìn)行有效的轉導。
較強的免疫原性：活腺病毒會(huì)在動物體内引起(qǐ)強烈的免疫反應，從而限制了其在個服體内的某些應用。
技術複雜：使用腺病毒載體時(shí)，需要在包裝細胞中産生活病毒，然後(能下hòu)測定病毒滴度。這(zhè)些過(guò)程技術難度更高，周期更長(c費喝háng)。
載體關鍵元件
5' ITR: 5' inverted terminal repeat. In wil山不d type virus, 5' ITR and 筆頻3' ITR are essentially identi但說cal in sequence. They re術們side on two ends of the vira們白l genome pointing in站吃 opposite directions, where they serve高動 as the origin of viral genome replic店區ation.
Ψ: Adenovirus packaging signal r道外equired for the packaging 生門of viral DNA into virus.
Promoter: The promoter driving your g醫吧ene of interest is plac間白ed here.
Lox2272: Recombination site for Cre去書 recombinase. Mutated Lox s醫場ite with two base su海河bstitutions of wild type LoxP. Inco些討mpatible with LoxP sites. Wh船美en Cre is present, the LoxP 船到and LoxP2272 sites will be cut and r機就ecombine with compatible sites.
LoxP: Recombination site for Cre re就線combinase. Inco動習mpatible with Lox2272 sites. Whe為兵n Cre is present, the LoxP and Lox刀區2272 sites will be cut and在爸 recombine with compatible sites.
Kozak: Kozak consensus sequence. It is門喝 placed in front of the start數樂 codon of the ORF of interest beca林快use it is believed to faci區工litate translation是睡 initiation in eukaryotes.
ORF: The open reading frame弟村 of your gene of interest is placed h上美ere, in a sense路下 orientation.
TK pA: Herpes simplex virus thymid雜你ine kinase polyadenylation signal. It 場相facilitates tra友雨nscriptional termination o男紙f the upstream ORF.
ΔAd5: Portion of Ad5 工體genome between the two ITR多熱s minus the E1A, E1B and E3 r服志egions.
3' ITR: 3' invert很玩ed terminal repeat.
pBR322 ori: pBR322 origin o友知f replication. Pl紙妹asmids carrying this origin exist in me腦多dium copy numbers in E. coli.
Ampicillin: Ampicillin res妹廠istance gene. I兒你t allows the plasmid to b業海e maintained by ampicillin select章商ion in E. coli.
PacI: PacI restriction site (PacI is a制答 rare cutter that cuts at TTAATTAA)窗內. The two PacI restriction sites o銀生n the vector can be used 身暗to linearize the vector頻湖 and remove the vector backbone fro飛金m the viral sequence, which is necess又時ary for efficient pac遠們kaging.
哺乳動物基因FLEX條件性表達腺病毒載體（Cre-Off）討音
概述
FLEX條件性表達腺病毒載體結車湖合了載體家的高效的腺病毒載體系統和Cre響應的FLEX條件性基因表達載體，可子書以幫助您實現在多種(zhǒng)多樣(yàng)的哺乳長件動物細胞中以腺病毒轉導Cre響應的FLEX基因表達調控開(kāi)關。FL女綠EX Cre-Off系統利用位于目厭們的基因兩(liǎng)側的Lox-變體重組位點，在Cre重組酶多影的調控下目的基因發(fā)生反轉，目的基因表達被(bèi)抑制。
FLEX Cre-off系統由兩(liǎng)對(場大duì)異型Lox-變體重組位點組成(chéng)男資，其中野生型序列稱爲LoxP，突變體稱爲Lox2272，分别位于請場ORF的兩(liǎng)側。 兩(liǎng)種門師(zhǒng)Lox-變體都(dōu)靜的可被(bèi)Cre識别，但隻有相同的Lox位點那匠對(duì)可以彼此重組，與其他水員Lox-變體不能(néng)進(jìn)黑要行重組。 LoxP和Lox2272位點以交替方式位于ORF兩(li朋林ǎng)端，每對(duì)位點互爲反向(x音理iàng)。Cre重組酶不存在的情況下，客戶定制的啓動子可以驅動目的基因你朋的正常表達。Cre重組酶存在的情況下，Lox畫跳P和Lox2272位點對(duì)門西分别重組，導緻ORF方向(xiàng)反轉爲反向(xiàng)，且其中的一她錯對(duì)重組位點將(jiāng)具有相同的方向(xi見業àng)，Cre會(huì)介導産生正向(xiàng)重通但組切割，繼而分别留下一個不同的重組位點。哥子ORF方向(xiàng)的反轉，使得目的基因無法正常表達。由于ORF側翼是兩(國歌liǎng)個不同的Lox-變體位點，所以即使存在Cre也不會(huì)進些現(jìn)一步發(fā)生重組。
腺病毒載體首先是以質粒的方式構建并使用E. coli擴增，然後紙內(hòu)線性化後(hòu)轉染進(jìn)入包裝細她身胞。在包裝過(guò)程中，位于兩(liǎng)個反向(這從xiàng)重複序列（ITR）之間的DNA片段與由包裝細胞表達的病毒蛋白吃了進(jìn)一步包裝成(chéng)病毒顆北錢粒。對(duì)于上述的FLEX介導的資新Cre-Off條件性表達腺病毒載體，FLEX Cre-Off開(長作kāi)關位于兩(liǎng)個ITR之雪金間。當病毒轉導宿主細胞時(shí數路)，載體并以遊離DNA的形式存在于細胞核中。
通過(guò)改造優化，我們的腺病毒載體缺失了E1A、E1B和E街人3區，前兩(liǎng)者與病毒包裝相關（這(zhè)站書兩(liǎng)個基因已被(bèi)整合到包裝細胞的基因組中）。因此，運謝請用我們的病毒載體包裝出來的病毒是複制缺陷型的（隻能(néng)轉導靶細胞空訊而不能(néng)自我複制），大大提雜科高了生物安全性。
關于該載體系統的更多信息，請參考以下文獻。
| 參考文獻 | 主題 |
|---|---|
| Proc Natl Acad S理樂ci U S A. 91:8802 (1994) | The 2nd generation adenovirus ve那厭ctors |
| J Gen Virol. 36:59 (1977) | A packaging cell line for adenovirus 房上vectors |
| J Virol. 79:5437 (2005) | Replication-competent adenoviru事微s (RCA) formation in 293 C熱秒ells |
| Gene Ther. 3:75 (1我喝996) | A cell line for testing RCA |
| Gene. 216:55 (1998) | Characterization of LoxP mutants, incl船了uding Lox2272 |
| Nat Biotechnol. 21:562 (2003) | Development of the FLEX s分木witch system |
| J Neurosci. 28:70到會25 (2008) | Application of a FLEX switch system |
亮點
FLEX Cre-Off條件性表達腺病毒載體專爲討來在哺乳動物細胞中實現高效的目的基因調控表達而設計。目舊水的基因受到用戶自定義的啓動子調節并且默認爲表達，但是紅事可以在Cre重組酶存在的情況下反轉ORF編碼方向(xiàng)使目的基因失活。林用
該載體由血清型5（Ad5）腺病毒衍生而來。經(jīng)優化錯睡，該載體系統在大腸杆菌體内具有很高的拷貝數，包裝的活病毒具有很高的滴度，藍也對(duì)大多數宿主細胞具有高效的轉導能(néng)力，能(néng)有效下飛地把載體整合到靶細胞基因組并實現外源基因的高水平表達。
優勢
基因失活可控：Cre重組酶存在的情況下，ORF方向(xiàng)轉爲反向(xiàng)，可雪數防止基因發(fā)生洩漏表達。
基因穩定失活：在Cre的存在下，LoxP和Lox2272位點對還商(duì)分别重組，導緻ORF方向(xiàng)永久性地轉睡國爲反向(xiàng)，且其中的一對(duì)重組位點將(jiāng)具有相同業會的方向(xiàng)，Cre會(huì)介導産生正向(xiàng)重組切割，相內繼而在ORF的兩(liǎng)端留下兩(物個liǎng)個不同的Lox-變體，即說小使存在Cre也不會(huì)進(jìn)一步發(fā)生重筆玩組，使得目的基因的表達永久失活。
對(duì)宿主基因組造成(chéng)破壞的低風險性：長黃在轉導進(jìn)入靶細胞後(hòu)，腺病毒載體在細胞核保持著(z腦雪he)遊離DNA的狀态，可以降低宿主基因組被(bèi們內)破壞而緻癌的風險，使其成(chéng)爲人類體内實驗的理想載體。
超高病毒滴度：腺病毒可通過(guò)再次轉導包裝細胞而得到大量擴增，吧鄉從而獲得超高滴度病毒，慢病毒載體、逆轉妹通錄病毒載體和AAV載體都(dōu)不身話具有這(zhè)個特性。我們提供的腺病毒滴度可以達到>1012 VP/ml。
載體容量非常大：腺病毒能(néng)有效包裝的基因組上限大小是~38.7 k街事b（從5' ITR到3' IT舊不R）。在除去腺病毒包裝表達所需主要元件所占用的容量之後(hòu)，熱報我們的載體具有約~7.5 kb的鄉睡裝載空間以容納目的DNA（例如啓動子，ORF和熒光标記）。相比起(qǐ)容綠土量爲6.4 kb的慢病毒表達載體，腺病毒載體容量更大，能(néng)計信滿絕大多數應用要求。
宿主範圍廣泛：來源于人、小鼠和大鼠等常用哺乳動物細胞都(dōu)紅我能(néng)被(bèi)腺病毒載體轉導，但某些細胞類型則不哥比較難轉導（見下文不足之處）。
體内外實驗均有效：我們的載體不僅能(néng)用于體内活體動物實驗，還(há亮山i)具有體外細胞轉導能(néng)力。
安全性高：爲了确保腺病毒載體的生物安全性，我們的腺病毒載體缺失了病毒包裝所必須的基因（學兒這(zhè)些基因被(bèi)整合到包裝細胞的基因組）。 所以，利用我器的們的腺病毒載體包裝出來的病毒是複制缺陷型的，并且隻有在問街包裝細胞中才具有複制能(néng)力。
不足之處
載體DNA非整合型：腺病毒基因組不會(huì)整合到靶細胞的基因組中，而是以遊離DNA的形式舊河存在，并且随著(zhe)時(shí)間推移逐漸丢失，特别是在分裂細胞中。藍子
難以轉導特定類型的細胞：雖然我們的腺病毒載體可以轉導很多類型的細胞包括非分裂細胞，但對(d綠書uì)某些特定類型的細胞如内皮細胞、平滑肌細胞、呼吸上皮分化細胞、外周血細人工胞、神經(jīng)元和造血幹細讀志胞等，卻無法進(jìn)行有效的轉導。
較強的免疫原性：活腺病毒會(huì)在動物體内引起(qǐ)強烈的免家弟疫反應，從而限制了其在體内的某吃什些應用。
技術複雜：使用腺病毒載體時(shí)，需要在包裝細胞討場中産生活病毒，然後(hòu)測定病毒滴度。這(zhè)些過(guò)程技術難好下度更高，周期更長(cháng)。
載體關鍵元件
5' ITR: 5' inverted termin謝路al repeat. In wild type virus, 5' ITR a綠見nd 3' ITR are essentially ide關可ntical in sequence. T熱鐘hey reside on two ends o中你f the viral genome pointing in opposit多遠e directions, where 議兒they serve as the origin of vira市錢l genome replication.
Ψ: Adenovirus packaging sign風老al required for the packaging見雜 of viral DNA i城機nto virus.
Promoter: The promoter driving your gene of i弟坐nterest is placed here我說.
Lox2272: Recombination site for Cre recombinase低微. Mutated Lox site with two子村 base substitution員票s of wild type LoxP. I女兒ncompatible with L時公oxP sites. When Cre i工行s present, the 可樹LoxP and LoxP2272 sites will be cut頻是 and recombine with compatible行愛 sites.
LoxP: Recombination site for Cre rec了少ombinase. Incompatibl森機e with Lox2272 sites. When Cre is pre訊說sent, the LoxP and Lox2272 si家嗎tes will be cut and recombine with comp光金atible sites.
Kozak: Kozak consensus sequence. It is能員 placed in front of the start codo民章n of the ORF of intere南會st because it is 頻村believed to facilitate translation i都村nitiation in eukaryotes.
ORF: The open reading frame o畫章f your gene of interest is pl紅間aced here, in a sense orientation.
TK pA: Herpes simplex virus thymi來是dine kinase poly視照adenylation signal. It facilitates影離 transcriptional termination美銀 of the upstream ORF.
ΔAd5: Portion of Ad5 genome遠工 between the two ITRs minus the 裡農E1A, E1B and E3 regio票很ns.
3' ITR: 3' inverted 訊城terminal repeat.
pBR322 ori: pBR322 origin of replication. Plasmids高線 carrying this origin exist in 紙能medium copy numbers in E. coli.
Ampicillin: Ampicillin resist著金ance gene. It allows the plasmid to討說 be maintained by ampici哥森llin selection in E. 笑白coli.
PacI: PacI restriction 請都site (PacI is a弟樂 rare cutter that cuts at 西刀TTAATTAA). The two PacI restriction 廠友sites on the vector can be use黑答d to linearize the vector and remo鐵紙ve the vector back生事bone from the viral sequenc分頻e, which is necess人師ary for efficient packaging.