雲舟生物提供一站式的mRNA療法開(kāi)發(fā)解決方案，如疫苗、基因計討編輯、CAR受體以及細胞或胚胎中的重組蛋白表達服務。術我我們的團隊擁有豐富的mRNA設計技書與生産經(jīng)驗，可以幫生家助研究者完成(chéng)體外轉錄載體設計、載見到體克隆、體外mRNA合成(chéng)、LNP-mRNA複上業合物制備、以及體外/體内的mRNA功能(néng)性用問測試，以加速mRNA疫苗與相關基因相文療法的藥物研發(fā)。
IVT 載體設計 
IVT mRNA制備和LNP封裝
質量控制
功能(néng)性驗證
體外轉錄（IVT）載體設計和克隆 IVT mRNA和LNP制備
圖1 mRNA合成(chéng)和 LNP封裝的典型流靜林程。
質量控制雲舟生物提供多種(zhǒng)QC方法驗證IVT m吧舊RNA和LNP封裝的質量。标準QC項目（打勾話畫項）默認在COA中提供。可選QC項目根據具體項目需求提供。
| 性質 | 分析方法 | 科研級别 | 臨床前級别 | |
|---|---|---|---|---|
| mRNA鑒定 | mRNA序列 | Sanger測序 | √ | √ |
| mRNA長(cháng)度 | 變性瓊脂糖凝膠電泳 | √ | √ | |
| 毛細管電泳（CGE） | 可選 | √ | ||
| 性質 | mRNA濃度 | UV分光光度計 | √ | √ |
| RiboGreen染色 | 可選 | √ | ||
| 外觀 | 目視檢查 | 可選 | √ | |
| 效力 | 表達效果 | 體外翻譯後(hòu)進(jìn)行化業Western blot | 可選 | 可選 |
| 細胞轉染 | 可選 | 可選 | ||
| 安全性 | 無菌性 | 生物負荷測試 | 可選 | √ |
| 支原體 | 培養法 | 可選 | √ | |
| qPCR | 可選 | 可選 | ||
| 内毒素 | 動态色譜法（KCA） | 可選 | √ | |
| 純度 | mRNA完整性 | 變性瓊脂糖凝膠電泳 | √ | √ |
| 毛細管電泳（CGE） | 可選 | √ | ||
| A260/280 | UV分光光度計 | √ | √ | |
| 加帽效率 | LC-MS | 可選 | √ | |
| PolyA分析 | LC-MS | 可選 | √ | |
| 殘留dsRNA | 斑點雜交 | 可選 | √ | |
| 殘留質粒 DNA | qPCR | 可選 | √ | |
| 殘留蛋白 | NanoOrange染色 | 可選 | √ | |
| 殘留溶劑 | 氣相色譜 | 可選 | 可選 | |
| 檢測項目 | 性質 | 分析方法 | 科研級别 | 臨床前級别 |
|---|---|---|---|---|
| LNP屬性 | 封裝效率 | RiboGreen染色 | √ | √ |
| 粒徑、PDI | 動态光散射（Zetasizer） | √ | √ | |
| 表面(miàn)電荷 | 動态光散射（Zetasizer）嗎黑 | √ | √ |
功能(néng)性驗證
IVT載體序列優化
圖2 優化的UTR改善mRNA表達效率。
高斯熒光素酶mRNA使用不同的UTR組合表現出不同睡時的表達水平。在12孔闆中接種(zhǒng)293T細胞，細胞密度2.3&tim請月es;105 細胞/孔。每孔轉染1 ug mRNA。轉染後(hò你玩u)6 h、24 h、48 h、72 我他h以及96 h，取20 ul細胞測定高斯熒光素酶活性。
圖3 對(duì)編碼序列進(jìn)行密碼子優化提高了mRNA的體外和體内表達謝下水平。
(A)HEK293T細胞中表達HiExpressTM螢火蟲熒光素酶IVT mRNA以及其它版本的熒光素酶mR冷跳NA。細胞生長(cháng)于12也術孔闆，每孔轉染0.5 ug mRNA。轉染後(hòu)6 雨作h、24 h、48 h以及72 h測定熒場友光素酶活性。（B）向(xiàng)C57新短BL/6成(chéng)年小鼠肌肉注射30 ug LNP包封的熒光素志藍酶mRNA，注射後(hòu)6 h、24 h、48 h測定熒光素酶活性。Fl站員uc WT表示野生型熒光素酶mRNA。鐘靜Fluc WT (co)表示經上理(jīng)過(guò)密碼子優化的熒光素酶mRNA。F紙書luc2表示luc2熒光素酶mRNA。HiE著笑xpressTM Fluc表示雲舟生物HiExpre歌個ssTM螢火蟲熒光素酶IVT mRNA。
圖4 polyA長(cháng)度分析。
使用核糖核酸酶將(jiāng)polyA尾巴從女制mRNA上切割下來，然後(hòu)進(j醫又ìn)行oligo dT親和色譜純化，LS-MS分析核苷酸信長影息。（A）基于尿素PAGE的poly看物A大小分析。變性尿素PAGE電泳mRNA酶切後(hò得術u)的60 ng 120 nt和150 nt的polyA姐這尾巴。（B）基于LC-MS 的polyA大小分析。120 nt長(購自cháng)度的120 p mo見唱l polyA分子量的逆卷積質譜結果。（C）期望爲120 nt的polyA錯海尾巴長(cháng)度觀測分布。柱狀圖表明pol這影yA長(cháng)度的同一性較好(hǎo)。誤差線表示3次酶切匠這試驗結果的标準偏差。polyA加權平均長(cháng)度爲123 nt。購和
圖5. HEK293T cells were transf刀聽ected with IVT EGFP mRNA with the same 腦船Cap1 and UTRs but d件房ifferent poly(A) tail lengths as 理朋listed above.
圖6 斑馬魚EGFP IVT mRNA體内表達。新員
使用250 pg斑馬魚EGFP IVT 外個mRNA顯微注射單細胞期斑馬魚胚胎樹下，注射後(hòu)6 h篩選EGFP表達效果。線作熒光圖像表明含有經(jīng)過(guò)優化的Kozak序列的mRNA（ve器草rsion 2）在體内表達效果更佳。
IVT mRNA體外轉錄優化
圖7 完整性良好(hǎo)的長(cháng)序費慢列IVT mRNA
使用變性凝膠電泳鑒定雲舟生物不同批次的IVT mRN通站A。在不同體外轉錄條件下均能(néng謝唱)獲得長(cháng)度>10,000 nt的序列完整的IVT 又錢mRNA。
圖8 基于LC-MS的加帽效率分析
（A）共轉錄法和（B）酶加法均能(néng)實現很高的草刀加帽效率。
圖9 修飾的核苷酸增強mRNA表達，同時(shí)減少dsRNA産生。
（A）293T細胞中表達螢火蟲熒光素酶IVT mRNA。使用的mR能船NA包括無修飾的、N1-甲基假尿苷（N1-methylpseudou話姐ridine，m1Ψ）修飾的、以及5-女動甲基胞苷（5-methylcytidine，m5C）修飾的。修購銀飾的。細胞生長(cháng)于12孔闆，每孔轉染1 ug mRN聽見A。293T細胞轉染螢光素酶mRNA算費後(hòu)6 h、24 h、48 h的螢著學光素酶活性。誤差線表示标準偏差。平均熒光強些刀度使用帶顔色的柱狀圖表示.(B呢鄉) 等量修飾的和無修飾的EGFP IVT mRNA（每斑點750 ng）經(可舊jīng)過(guò)磁柱純化，使用斑點雜交估測dsRNA雜質行呢含量。
殘留dsRNA是IVT産物中主要長些引起(qǐ)免疫反應的雜質。 斑點雜交試驗結果表明額外的純化步驟離區毒藥去除殘留dsRNA至關重要。
圖10 不同純化方式的dsRNA去除效率。厭水
不同的純化方式純化等量的hSpCas9 IV公技T mRNA（每斑點1500 ng），然後(hòu)使用斑點雜交估測殘留dsR事近NA。縮寫：HIC，Hydroph費開obic interaction chromatography；IP腦通-RP，Ion-pair re國西versed-phase liquid chroma物讀tography。
LNP-mRNA QC數據雲舟生物的LNP-mRNA産品采用優化過(guò)後(hò靜雪u)的封裝技術，具有良好(hǎo)的均一快草性、穩定性和遞送效率。
冷凍透射電子顯微鏡（cryo-T頻行EM）結果顯示我們封裝的LNP裡會-mRNA結構完整且大小均一。
圖11 冷凍透射電子顯微鏡（cryo-TEM）視野下的LNP-mRNA
LNP保存于-80℃含有蔗糖的Tris溶液暗裡（pH7.4），冰上解凍後(hòu)拍攝。比例尺動購=100 nm。
動态光散射（DLS）分析表明我們的LNP-mRNA可以達到很低的PD煙唱I值（PDI<0.1）。雲舟生物承諾我們白光的LNP-mRNA的Zeta電勢範圍在-10 mV至+10 mV之間。&n地業bsp;
圖12 LNP粒徑和Zeta電勢分析多分散指數（PDI）
（A）和Zeta電勢（B）通過(guò)動态光散射（少山DLS）測定。該方法可以測量粒動北子運動帶來的散射光強度的波動變化。反映的則是樣(yàng)水他本中的粒子尺寸的異質性。樣(yàng)本中年照的Zeta電勢範圍在-1.872到+1.872 mV之間錯鐵。
LNP-mRNA功能(néng)驗證
圖13 使用LNP高效遞送mRNA
對(duì)比使用傳統轉染試劑，LNP封裝的EGFP mRN房服A表現出更高遞送效率。向(xiàng)Jurkat和293T細得懂胞轉染1 ug的EGFP mRNA： （A）林鐵流式細胞術分析EGFP表達水平。（B）轉染後(hòu)24 h拍攝細胞熒光讀鐘圖片。實驗中使用的EGFP mRN長麗A均無核苷修飾。 熒光強度中值表示爲MFI。
圖14 小鼠轉導螢光素酶mRNA（Luc mRNA），檢測mR少聽NA表達情況和免疫反應。
（A）注射後(hòu)6 h、24h、和4嗎會8 h通過(guò)活體成(chéng)像檢測螢光素酶活性。 （B）爲量化兒長外源RNA在小鼠中引發(fā)的炎症反應，注射後(h討件òu)48小時(shí)檢測小鼠血清中兩(liǎng)種(zhǒ南低ng)促炎細胞因子IL-6和TNF-α的房輛濃度。 誤差線表示标準偏差。小鼠種(zhǒng)系：C57身兵BL/6J；小鼠年齡：8周；注射方法土公：肌肉注射。（C）向(xiàn視科g)Balb/C小鼠注射30 錢動ug的LNP封裝的mRNA，注射後(hòu)14天，分離Balb/湖玩C小鼠的脾髒細胞，針對(duì)病毒抗原A、病毒抗原B以及PBS懂民對(duì)照進(jìn)行IFN-γ ELISpot試驗。
抗體偶聯的LNP通過(guò)血管注射LNP時(shí)，由有購于LNP傾向(xiàng)于在肝哥費髒細胞積累，需要人工提升LNP靶向(xià開謝ng)其它組織細胞的效率。 雲舟生物已建立抗體厭低偶聯的LNP-mRNA生産系統，可制備具坐玩有組織特異性的LNP-mRNA。
圖15 LNP-mRNA偶聯不同的抗體坐間分子影響其生物分布
通過(guò)將(jiāng)LNP偶雜動聯特定抗體， 在一定劑量下可增強LNP對(duì線國)肺的靶向(xiàng)性。向(xiàng)C57BC/6森愛J 小鼠（6-8周、雌性）尾靜脈注射Fluc LNP-mRN師外A，分離的組織中生物發(fā)光表明Fluc的表達。外男 陰性對(duì)照爲無LNP封裝的普通IVT mRNA，同大數類對(duì)照爲IgG2a偶聯的Fluc-mRNA門山。
使用說(shuō)明書
手冊與宣傳單
MSDS
品質檢驗證書（COA）
檢索COACap 0是指將(jiāng)N7甲基鳥苷（m7G）以5'著見至5'三磷酸連接的方式添加到真核mRNA些紅的5’端。這(zhè)種(zhǒng)修飾是通過(guò)一系列共轉快公錄酶促反應添加的，其功能(néng)是調節細胞核輸出、轉錄穩定性，工兵并通過(guò)真核翻譯起(qǐ)始因子（eIF4E）的識别促進(jìn吃媽)mRNA的翻譯。Cap 1是指除了東自m7G Cap之外，進(jìn)一步在轉錄mRNA序列的第一個核苷酸（筆讀m7GpppNm）的2' O上添加甲基。在哺乳動物細胞中，紙醫Cap 1結構是mRNA被(bèi)識别爲自身而非先天免疫靶向(志志xiàng)的重要标志。在合成(chéng)的mRNA中添加Cap 1結暗事構可以增強體内mRNA的表達并降低其免年機疫原性。
體外轉錄mRNA的5'帽子可以以加入Cap類似物共轉錄的方式添加，熱動也可以通過(guò)酶促反應在轉錄後(白慢hòu)添加。我們提供了兩(liǎ場短ng)種(zhǒng)加帽方式，其效率已通過(guò)LC-MS驗證表現良好(見很hǎo)。根據客戶首選的加帽方法，街不我們將(jiāng)從一開(kāi)我月始就(jiù)選擇一個兼容的載體骨架來克唱飛隆IVT mRNA載體。
細胞包含位于胞質的和内涵體的兩(liǎng)類RNA受體，它們在識别外源R空去NA時(shí)將(jiāng)激活免疫反應。修飾核苷酸通司土常存在于細胞的内源性RNA中。在IVT mRNA中加入某些修新議飾的核苷酸可降低其免疫原性，改變二級結構，并計中以序列依賴的方式提高翻譯效率和延長(chán低到g)半衰期。我們提供了多種(zhǒng)類型的修飾核苷酸，包括常用的長年N1-甲基假尿苷（m1Ψ）和5-甲基胞苷（m5C）。N1-甲基假尿苷和5-甲基吃上胞苷是最早發(fā)現的天然來源是 tRNA，然而，它們在 mRNA 中的電友功能(néng)直到最近才得到重視為和。尿苷和胞苷的這(zhè)些甲基化衍生物可以在mR公日NA IVT和翻譯中取代它們使用的默認核苷，姐對而不改變傳統的Watson-Crick堿基配對(duì)。在mRNA治療新術中使用它們的一個主要優勢是它們能(néng)夠幫助去事RNA規避免疫受體的識别，從而減輕不必要的免疫反應，明呢增強轉錄穩定性和翻譯效率。
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